文献信息

题目：宏基因组二代测序在感染性疾病中的诊断价值

发表期刊：BMC Infectious Diseases

IF：2.688

作者：同济大学附属第十人民医院呼吸科王昌惠教授团队

 

研究背景

目前传统的感染诊断技术虽然成熟，价格优惠，但大多费时费力，阳性率低。宏基因组二代测序技术因其对所有病原体的鉴定和分型不依赖于培养、无偏好地提取样本总DNA而被广泛研究。

研究方法

研究对象：

2018年10月至2019年12月上海市第十人民医院就诊的109例成年患者。根据最终诊断将患者分为感染(ID)组（n=92）、非感染 (NID)组（n=16）和未知组(Unknown)（n=1）。对样本进行mNGS检测，并同时进行临床微生物检测，由临床医生根据mNGS和培养的结果，以及患者的影像学、临床特征进行最终诊断。同时收集所有入选患者的临床资料，包括外周血白细胞、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、中性粒细胞计数，用ELISA法检测血清的IL-2、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-17A、IL-10、干扰素-γ（INF-γ）的含量。纳入和排除病例的流程图下图所示。

纳入和排除病例的流程图

宏基因组二代测序与分析：

1、样品处理和文库构建

对感染或不明原因发热的患者，按标准程序采集感染部位样本或血液。当临床医生特别怀疑细胞内细菌感染时，将血液样本离心以分离血浆和白细胞。

每次试验均包括内参、阴性对照和阳性对照。内参是一个特定的分子标签，在核酸提取之前放置在样本中，以跟踪整个过程并控制DNA的质量。阴性对照的检测结果应为无病原体。如果检测到相关病原体，说明环境中可能存在DNA污染源。阳性标本中含有特异的微生物DNA。

2、生物信息学分析

90%以上的序列为人类宿主序列，需去除。微生物检测序列的长度需要大于50bp，在不去除人类基因组成分的情况下有效测序数据量不应小于20M。报告中列出的物种是本次测试中检测到的所有微生物。根据序列数从高到低排列。当报告进入临床后，从临床角度判断检测到的疑似病原体是否与感染有关，并结合检测参数进行最终诊断。

研究目的

      比较mNGS技术与传统培养方法检测病原体的差异，探讨mNGS检测结果对感染患者病情严重程度和预后的影响。

研究结果

1、样本和患者特征

      参与研究的患者中，男性87人，女性22人，平均年龄61岁，平均住院天数17.5天，病死率为11.9%。109例标本中，血液占33.9%(37)，BALF 33.0%(36)，组织11.0%(12)，痰8.3%(9)，胸水6.4% (7)、脑脊液3.7% (4)、脓液1.8% (2)、骨髓0.9% (1)和鼻拭子0.9% (1)。在研究队列中，92例(84.4%)找到确定病原体的患者被归入ID组。其余标本分为NID组(16/109，14.7%)和未知组(1/109，0.9%)。ID组和NID组在年龄、性别、住院时间和病死率方面无统计学差异(P均>0.05)。大多数患者被诊断为呼吸系统感染(73/109，67.0%)，其次是血液感染(10/109，9.17%)，胸腔积液(6/109，5.50%)和中枢神经系统感染(6/109，5.50%)。

A.本研究中样本类型及所占比例

B.根据常规诊断将患者分为ID组、NID组和未知组。

C.ID组患者感染部位

2、mNGS与培养法对ID和NID诊断性能的比较

      在所有样本和ID组样本中，mNGS与培养的结果有统计学差异，而NID组和未知组无统计学差异(P>0.05)。

A:mNGS与培养方法比较

      mNGS诊断传染病的阳性预测值为92.3%，阴性预测值为27.5%。mNGS与培养法相比，敏感性提高了约44%(67.4% vs 23.6%; P < 0.001)。与培养法相比，特异性降低了12.5%(68.8%vs81.3%；P=0.41)。

B：mNGS与培养法的敏感性，特异性，阳性预测值，阴性预测值

3、mNGS与培养法检测病原体的一致性

      109例患者中21例(19.3%)mNGS和培养的结果均阳性，25例(22.9%)均为阴性。单纯mNGS阳性的有58例(53.2%)，单纯培养阳性的有5例(4.6%)。在21例双阳性病例中，3例完全一致，3例完全不一致。其余15例部分一致。如下图所示：

C：3组标本的mNGS和培养阳性分布

4、mNGS的“假阳性”和“假阴性”

      在ID组中，mNGS漏检了3种可培养的病原体。在3例“mNGS假阴性”标本中，有2例培养结果与临床诊断不符，另1例完全不能被mNGS鉴定。同时，NID组7例“mNGS假阳性”的原因可能包括潜在合并感染(3/7)、过度解读(3/7)和不明原因(1/7)。

mNGS的“假阳性”和“假阴性”

5、病原体和标本的mNGS技术与培养检测的比较

病原类型比较分析

      克雷伯氏菌(10/69)是最常见的病原菌，其次是结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌(9/69)、曲霉(6/69)、假单胞菌(6/69)和EBV(6/69)。mNGS阳性检测结果高于培养法，但差异不显著(P>0.0 5)。

ID组病原体分布

样本类型比较分析

      在BALF、组织、血液和痰液中，mNGS检测的敏感性显著高于培养法(P = 0.002 for BALF, P = 0.025 for tissue, P < 0.001 for blood, P = 0.018 for sputum)，两种方法在胸水、脑脊液、脓液、骨髓和鼻拭子的敏感度则无显著性差异(P>0.05)。在培养方法中，BALF阳性率高于血液(P=0.0 0 1)。

mNGS与培养法检测感染性疾病的样本分布

6、ID组中mNGS阳性组与阴性组感染指标的比较

      mNGS阳性组与阴性组白细胞、淋巴细胞计数差异不显著(P>0.0 5)，mNGS阳性组与阴性组比较无显著差异(P>0.0 5)。

      阳性组外周血中IL-10浓度显著高于阴性组(P=0。0 4 4)，其他细胞因子间无显著差异(P>0.0 5)。

mNGS检测阳性组和阴性组白细胞、细胞因子和淋巴细胞计数

7、mNGS阳性结果的相关因素分析

      对患者资料及患者体内是否检出病原体进行分析。剔除混杂因素后，对检测有意义的变量为年龄(P=0.037，OR：1.076，95%CI：1.005~1.152)，可帮助病原体的检出。

患者病原体DNA阳性相关因素分析

8、mNGS的临床价值

1、检出病毒对抗生素使用的影响

      23例患者共检出4种病毒，以单纯疱疹病毒(n=15)为主，其次为EB病毒/单纯疱疹病毒(n=5)、EB病毒(n=1)、甲型肝炎病毒(n=1)和TT病毒(n=1)。10例患者抗生素使用可能不当，在通过mNGS确定真正的病原体并在此基础上调整抗生素使用后，患者的病情有所改善。23例中有7例为免疫缺陷宿主，其特征为免疫系统缺陷或由感染因素、霉菌毒素、药物和营养缺乏引起的免疫反应。

病毒分离株患者的临床特征(n=23)

2、mNGS阳性对患者住院天数和生存率的影响

      mNGS阳性组住院天数较阴性组长(HOD，176.63天vs150.96天，P=0.047)，28日死亡率更高(9.0%vs 0%，P=0.049)。14d死亡率(4.5%vs 0%，P=0.278)和90d死亡率(13.4%vs 3.9%，P=0.180)无显著差异。

患者临床特征

      两组平均生存时间分别为176.64天和150.96天，组间t检验P值为0.425，无统计学差异。两组的存活曲线如下图。

mNGS阳性组和阴性组的生存曲线

      同时，我们分析了病原体读数与HOD、14天死亡率、28天死亡率和90天死亡率的关系，结果表明，病原体序列数越高，90天死亡率越高，HOD时间越长。

病原体读数与HOD、14、28、90天死亡率的分析

 

研究结论

      1、mNGS的敏感性高于培养，受抗生素影响较小，尤其对于BALF、血液和痰标本，此外对克雷伯氏菌、CMV和EBV的敏感性更高。

      2、与mNGS结果阴性组相比，阳性组患者预后趋势较差，这提示临床应给予其更多关注。

      3、患者年龄对病原体的检出有一定的影响，老年人更有可能出现阳性结果，并且阳性可能预示患者预后较差。

      4、基于以上发现，结合mNGS的其他优点，我们建议今后mNGS应更多地应用于病原感染的早期诊断。

 

关于金匙医学

      “金匙Genskey”取“基因钥匙”的含义，寓意企业以基因科技作为破解感染诊断难题的金钥匙。金匙医学的核心技术是感染病原高通量检测技术，为广大医疗工作者提供全面、准确、快速的病原微生物检测产品及服务。金匙医学研发中心坐落于北京中关村昌平生命科学园，是中关村高新企业，第三方医学检验所分别位于北京、天津、上海、广州，另在天津建有GMP车间，生产病原诊断医疗器械。

     
      金匙医学已获得数个I类，II类注册证，2项已授权发明专利，二十余项计算机软著。并与多家顶级临床院所深入合作，发表4篇高分SCI文章。在新型冠状病毒疫情期间，金匙医学联合四川大学华西医院开展SARS-Cov-2变异分析研究，并在国际病毒学权威杂志Journal ofVirology发表合作研究论文。

     
      金匙医学与中日友好医院、北京大学人民医院、首都医科大学附属北京同仁医院、四川大学华西医院、中国医学科学院血液学研究所血液病医院、河南省肿瘤医院、陆道培医疗集团等顶级院所建立了深入合作关系，面向呼吸、血液、检验、重症、感染等科室，提供病原微生物宏基因组诊断产品及检测服务的整体解决方案。

     
      金匙医学开发的“新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)”、“新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)”和“新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(可逆末端终止法)”均已取得CE准入资格。2020年7月，金匙医学研发的病原微生物测序数据分析软件”成功获得医疗器械注册证，该软件提供包括细菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体、病毒以及真菌的最全类别病原信息，将为临床感染性疾病的诊治提供重要且更为全面的参考。

     
      金匙医学已获得国家级科技型中小企业、天津市雏鹰企业、天津市战略性新兴产业领军企业等荣誉称号;在CHC医疗咨询联合中信证券在线发布的“2019年度中国医疗大健康产业投融资荣誉榜”中荣获“中国医疗健康产业最佳新锐奖”;在“2020年中关村国际前沿科技创新大赛”中荣登“病毒检测技术专场TOP10榜单”，同时在2020年荣获国家高新技术企业称号