编者按

　　宏基因组测序技术得益于其卓越的时效性和敏感性已广泛应用于临床，相关的临床研究也常见诸于报端。目前临床上应用较多的二代测序平台虽然广获好评与认可，但也存在一些不足，如读长较短(降低了物种基因和耐药基因比对特异性)、耗时相对较长等等。基于临床医生和患者更高的诊疗需求和严峻的抗感染治疗现状，第三代宏基因组测序技术——纳米孔测序正慢慢走向临床。

　　本文将与各位读者一起回顾Nature Biotechnology刊登于2019年7月的封面文章，共同探讨纳米孔测序应用于细菌性下呼吸道感染诊断的临床表现。
 

文献信息

题目：Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection

期刊：Nature Biotechnology(IF=36)

通讯作者及单位：Dr. Justin O’Grady 英国东英格利亚大学

 
结论速览

      基于纳米孔测序平台和高效的人源DNA去除(皂苷法,人源核酸去除率99.99%)，作者开发了一种用于细菌性LRI诊断的宏基因组学方法，该方法在40个样本上进行了预试，并在41个样本上进行了优化和性能检验，对病原菌的检测灵敏度为96.6%，特异性为41.7%，并且能够准确检测出耐药基因。

      经过定量PCR和病原特异性基因分析，特异性和敏感性均提高到100%。纳米孔测序平台可以快速(该研究从样品到结果仅需6h)准确地鉴定LRI病原，有助于减少广谱抗生素的使用。

 

研究背景 

 

 

 

 

 

 

 

 

2016年，LRIs在全球造成至少300万人死亡，在英国，CAP每年造成约29,000人死亡，在美国，HAP每年造成约36,000人死亡；

 

 

下呼吸道感染多为细菌性和病毒性病原体的混合性感染，给诊断和治疗带来了极大挑战；

 

 

呼吸道感染占英国全科抗生素处方的60%，经验性广谱抗生素的滥用会破坏人体正常菌群，并可能导致耐药细菌和艰难梭菌的出现；

 

 

核酸扩增技术（包括PCR）应对复杂性混合感染效果不好，同时需要不断优化流程来应对新出现的耐药基因和突变；

 

 

宏基因组测序方法可以克服培养和PCR的缺点，下一代测序平台（Ion Torrent和Illumina等）被广泛用于临床病原鉴定，但它们需要测序运行完成后才能开始分析。

 

预实验结果与常规培养法比较

　　对40例(P1-P40)疑似细菌性LRI患者的呼吸道样本进行预实验检测,全流程耗时8小时，宿主核酸去除率高达99.9%(皂苷法，qPCR测定)，利用ONT公司的WIMP(What’s in My Pot?)数据库进行基因比对。

　　预实验检测的40份样本中，有5份检测到培养法未检测到的病原体:卡他莫拉菌(P8)、大肠杆菌(P14)、流感嗜血杆菌(P22、P30)、肺炎克雷伯菌和卡他莫拉菌(P29);3份未检测到培养法检测到的病原体——P3和P37中分别没有检测到肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，P34中未检出金黄色葡萄球菌。
 

验鉴定结果与常规培养鉴定结果比较

纳米孔测序流程优化

      研究者试图通过改善细胞的裂解来提高敏感性(8.6%的假阴性率)，对比珠磨法及混合酶法对两种培养阳性痰液的裂解效果，一种含金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)，一种含绿脓杆菌(革兰氏阴性)。混合酶法使金黄色葡萄球菌样本中的细菌DNA数量增加了约4倍，珠磨法增加了21倍。

      研究者决定将珠磨法加入优化流程并去除第二次DNase处理和减少清洗次数(将宿主DNA去除程序从90分钟缩短到50分钟而不影响效率);文库制备PCR单循环延伸时间从6分钟减至4分钟。总的来说，这些变化将宏基因组文库的准备缩短到2.5小时，在DNA测序前的总准备时间不到4小时。
 

图1.预实验（Pilot)及优化实验（Refined)流程对比图

模拟微生物群落检测

验证皂苷法去除人源细胞是否会造成病原DNA的损失

      研究者将病原菌加入到正常样品中(~103–106 cfu)，一式三份;发现大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌并没有细菌DNA的损失(ΔCq < 1))，肺炎链球菌损失5.7倍(平均 ΔCq = 2.52)(见下表)
 

表2.皂苷法去除人源细胞对病原DNA的影响情况

优化方案测试

测试结果

 

      利用41例（S1-S41)疑似LRI患者的呼吸道样品测试优化流程。未去宿主和去宿主的样本之间人源DNA含量平均相差10⁴倍。优化方案灵敏度为96.6%，特异性为41.7%，全流程耗时6h，其中纳米孔测序（MinION sequencing） 2h。

      优化后的方法可以检测到常规培养方法能检测到的所有病原菌，在8例样本中检测到常规方法无法检测到的病原菌：肺炎克雷伯菌（S5)、绿脓杆菌（S7）、卡他莫拉菌（S14、S39）、肺炎链球菌（S8、S15）、金黄色葡萄球菌（S29)、化脓性葡萄球菌(S27)。

      在7个常规培养法报告为NRF（正常定植菌）/NSG（无特异菌检出）的样本中，还观察到多达2种潜在致病菌：流感嗜血杆菌和肺炎链球菌（S10、S21）、肺炎链球菌（S11、S28）;卡他莫拉菌和流感嗜血杆菌（S12）;流感嗜血杆菌（S31），大肠杆菌(S32)

      S9样本培养法报告病原菌绿脓杆菌和大肠杆菌，优化方案只检测出大肠杆菌。

 

测试结果验证

      研究者利用定量PCR对这16例不一致样本（19种病原微生物）进行验证，宏基因组检测到的19个病原菌中有12个通过qPCR也检测到，这将优化方案的特异性提高到了83.3%。qPCR没有检测到S9号样品中的绿脓杆菌，进而将敏感性提高到了100%。

 

      研究者对具有有潜在致病菌的样本进行物种特异性基因的分析，该分析用于判断基于WIMP数据库的比对是否错误分类。样品中包含大于1个流感嗜血杆菌 (siaT) 或者肺炎链球菌 (ply) 特异性基因片段就被认为存在这种致病菌。

 

     基于这种方法我们发现18个样品中有5个样本都检测到了流感嗜血杆菌 或者肺炎链球菌，虽然之前的流程和qPCR都没有检测到。与培养和qPCR常规方法相比，结合物种特异性基因分析我们的检测方案的敏感性和特异性都优化到了100%。
 

表3.优化方案鉴定结果与培养法比较

耐药基因预测

      纳米孔测序鉴定了41个标本中的183个抗性基因。在183个抗性基因中，26个是固有的。剩下157个，其中24个与所见的表型相匹配，4个基因部分匹配，基于这些抗性基因结果，作者结合抗性测试，可以解释部分病原菌的抗生素抗性表型。但是仍然有9个抗性表型尚未通过测序得到的抗性基因解释。
 

表4.基于优化的流程在ARMA中发现与病原菌生长相关的抗性基因

基因组装(基于参考基因组)

      研究者选取两个含有耐药菌的样本，直接通过宏基因组测序数据进行基因组组装。该分析表明，全基因组测序可以直接利用纳米孔下呼吸道测序数据，用于公共卫生和感染控制。

      样本1(S16)：MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)

      样本2(S10)：E.coli(对阿莫西林、复方阿莫昔拉夫和复方新诺明耐药)

      组装数据：两个样本的2h和48h测序数据(每个样本分为去人源和不去人源两组)

 

组装结果——MRSA样本

基于2小时的测序数据：

      去人源组基因组覆盖度达到了47.9×，组装了28个contigs(最长的片段479kbp，N50为400kbp);

      不去人源组的基因组覆盖度仅为3.9× 拼接成了69个contigs。

基于48小时的测序数据：

      去人源组基因组覆盖度达到了228.7×，组装了22个contigs(最长的片段481kbp，N50为403kbp);

      不去人源组的基因组覆盖度为17.5× 并且拼接成了33个contigs。

 

组装结果——E.coli样本

基于2小时的测序数据：

      去人源组基因组覆盖度为33.5×，拼接成了83个contigs( 最长 为437 kbp，N50 = 165 kbp);

      不去人源组的基因组覆盖度为0.2×。

基于48小时的测序数据：

      去人源组基因组覆盖度为165.7× ，共得到72个contigs( 最长的 contig = 474 kbp N50 = 178 kbp);

      不去人源组基因组覆盖度仅仅提高到1.1×。

 

 图2.测序48小时后组装的MRSA和E.coli基因组草图

时间点分析

MRSA样本

测序5分钟内：

　　去人源组(Depleted)具有1.6×基因组覆盖度，不去人源组基因组覆盖度仅为0.2x;

　　去人源组在相同的时间点检测到两条mecA基因片段，不去人源组(Control)检测不到mecA基因。
 

图3. 2h测序过程中去人源和不去人源组MRSA基因组覆盖度(左）以及mecA基因的检出条数对比（右）

 

E. coli 样本

      去人源组在20分钟内基因组覆盖度为5.7×，不去人源组基因组覆盖度仅为0.06×。

      去人源组测序20分钟后检测到3种耐药基因，测序2h后, 检测到47条blaTEM基因, 37条sulf1基因 和 21条dfrA17基因;不去人源组测序2h后未检测到blaTEM 和dfrA17 基因，检测到一条sul1基因。
 

图4. 2h测序过程中去人源组和不去人源组E. coli 基因组覆盖度(左）及三种耐药基因的序列数量变化（右）

 

编者寄语

      与二代测序相比，纳米孔单分子测序技术能够做到边测序边分析，且读长可控(从几十bp到几百万bp)，正因为其无与伦比的便携性、时效性、安装操作的简易性，使其一经推出便被寄予厚望。经过十几年的发展与优化，该技术已被广泛应用于科研、临床、疾病预防和食品安全等领域。

      未来，随着科学观念的渐渐普及、测序需求的不断增长、相关技术的迭代完善，纳米孔测序技术必将拥有日益广阔的应用场景，正如ONT公司的目标一样："Our goal is to enable the analysis of anything, by anyone, anywhere。"

 

 

关于金匙医学

 

金匙医学成立于2017年，坐落于北京昌平中关村生命科学园，公司不断深耕分子诊断技术在感染领域的应用。金匙医学与中日友好医院、北京大学人民医院、四川大学华西医院、中国医学科学院血液学研究所血液病医院、陆道培医疗集团等顶级院所建立了深入合作关系，服务临床千余家，面向呼吸、血液、检验、重症、感染等科室，提供病原微生物宏基因组诊断产品及检测服务的整体解决方案。 

 

金匙医学北京和天津公司是国家高新技术企业，已获得国家级科技型中小企业、天津市雏鹰企业、天津市战略性新兴产业领军企业等荣誉称号；获评2020年中关村“病毒检测技术TOP10”；连续两年蝉联清科集团评选的Venture 50最具投资价值企业，动脉网评选的未来医疗100强。 

 

金匙医学是业内发布了基于二代测序和三代测序病原微生物高通量检测产品的企业，也是行业内实现进口和国产测序平台双双高分通过国家临检中心mNGS室间质评的企业。金匙医学是一家拥有直接针对临床样本进行宏基因组分子耐药表型预测产品的企业，金识原血流感染检测产品是同类产品中通过中国食品药品检定研究院注册检并进入临床试验的产品。 

 

金匙医学在北京、上海、广州、天津拥有自己的医学实验室，面积超过17000m²，在武汉、成都、西安与当地医学实验室均有合作。此外，金匙医学协助郑州、深圳、南昌、济南、昆明、海口、南京等多家三甲医院实现院内开展病原基因检测项目。

 

金匙医学多位合伙人来自顶级外资药企、硅谷著名临床诊断公司以及国内成功基因检测类公司的管理层，多数从业时间都在二十年以上。公司现有员工400余人，企业90%以上人员为生命科学和临床医学背景，普遍在基因测序、医药、诊断企业，医疗机构和微生物研究机构工作多年。企业20%以上人员拥有博士学历，50%以上人员拥有硕士学历。 

 

金匙医学已获得数个I类，II类注册证，2项已授权发明专利，二十余项计算机软著，并与多家顶级临床院所深入合作，发表20余篇高分SCI文章，其中共一和共通讯作者文章5篇。2020年7月，金匙医学研发的“病原微生物测序数据分析软件”成功获得医疗器械注册证。