【文献速递】新一代宏基因组测序对临床脓肿液病原体的检测
发布时间:
2021-09-15
脓肿在临床上常表现为人体各器官或系统的局部组织坏死,多由微生物感染引起。快速、准确地鉴定临床脓肿标本中的病原菌对临床医师准确选择抗菌药物治疗具有重要指导意义,但如何从感染性临床样本中快速准确地诊断病原体仍然是一个挑战。 宏基因组新一代测序技术(mNGS)具有独立于病原体的分离和培养的性能,且能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(病毒,细菌,真菌,寄生虫、分枝杆菌等),目前已越来越多
文章题目:新一代宏基因组测序对临床脓肿液病原体的检测
发表期刊:Folia Microbiologica
发表时间:2021年4月
IF: 2.099
作者:深圳内源性感染诊治研究重点实验室邓启文教授团队
文章亮点:临床上鲜有的评估mNGS对人体脓肿液中的病原微生物检测的准确性
Part 1 研究背景
脓肿在临床上常表现为人体各器官或系统的局部组织坏死,多由微生物感染引起。快速、准确地鉴定临床脓肿标本中的病原菌对临床医师准确选择抗菌药物治疗具有重要指导意义,但如何从感染性临床样本中快速准确地诊断病原体仍然是一个挑战。
宏基因组新一代测序技术(mNGS)具有独立于病原体的分离和培养的性能,且能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(病毒,细菌,真菌,寄生虫、分枝杆菌等),目前已越来越多地应用于感染性疾病的病原体检测。
Part 2 研究目的
评估mNGS和传统培养方法对来源于不同器官或系统的临床脓液样本的微生物检测的准确性
Part 3 研究方法
1. 患者群体与脓液提取
采集2016.4–2019.5在中国深圳南山人民医院住院的9名脓肿患者的脓液。9例患者均在应用经验性抗生素前进行了脓肿手术引流治疗,标本提取后采用mNGS和常规细菌培养两种方法检测病原菌,并对两种方法进行比较。
2. 样本制备与mNGS检测
取1mL脓肿标本,加入50μL蛋白酶K和100μL 20% SDS缓冲液,在60℃下孵育20min,根据说明书使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen),经离心纯化后吸取200 μL上清液,提取DNA。提取后的DNA经超声破碎,得到200个500bp的片段。然后,利用Ion Plus片段文库Kit (Life Technologies),根据说明,通过末端修复、适配器连接、乳剂PCR扩增等方法构建DNA文库。采用安捷伦2100生物分析仪对DNA库进行质量控制。在mNGS测序过程中,以106拷贝/mL的细胞作为阴性对照,副鸡禽杆菌作为阳性内参。最终的文库使用Ion Proton (Life Technologies)进行了测序。
3. mNGS的数据分析
通过去除低质量的读取、残留的适配器和短的读取,对原始数据进行预处理。使用Burrows-Wheeler Alignment (bwa, v0.7.17)进行序列比对删除人类参考基因组(hg19)的序列。随后,将其余序列与细菌、病毒和真菌数据库(NCBI)进行比对。通过比对和综合评价严格映射读取数、覆盖率、深度等多项指标后,使用R(https:// www.r-project.org/)对这些流程和与基因组覆盖图比对的序列进行绘制,将怀疑病原微生物列出。
Part 4 研究结果
1. 患者的基本特征
9例患者中有6例患者无其他病史,传统细菌培养方法的检测结果均为单一致病菌,其中病例6患者传统细菌培养结果为阴性。具体如表1所示:
2. mNGS的检测结果
用于mNGS检测的脓肿液中大部分DNA是人源性,而微生物种类的DNA序列占总DNA序列数的0.05 - 0.5%,表明在不同的临床样本中,总微生物的百分比存在显著差异。从图1中可以看出,传统细菌培养法在脓肿液中发现的优势菌种,也可以通过mNGS法检测到相应的高水平DNA拷贝数。此外,mNGS还能发现多种微生物的混合感染。在本研究中,8/9脓肿液中优势微生物制剂的DNA读数频率超过总微生物组DNA读数的80%。其中有6例mNGS鉴定为致病菌的优势菌剂与常规细菌培养结果完全一致。在病例5和病例9中,虽然常规细菌培养发现的病原体与mNGS检测的优势菌种不一致(图1),但mNGS能检测到在常规细菌培养中难以检测到的病原体的DNA读数,说明mNGS检测病原体的敏感性较高。具体检测结果如图1所示:
图1 mNGS的检测结果
注:每个样本中只有相对丰度最高的细菌才显示在百分数柱状图中。相同的结果意味着培养的细菌与相对丰度最高的细菌相同。
3. mNGS检测到的优势菌的深度和覆盖率
通过mNGS检测到的DNA读数,可以绘制出两个病例中优势菌种的相对完整的基因组覆盖范围(图2E,I),这表明该方法在进一步分析微生物的生态特征方面具有优势。mNGS检测出的不同脓液样本中的肺炎克雷伯菌和化脓性链球菌的基因覆盖率在整个基因组中显示出相似的特征(图2A-D),这可能是由于在文库构建或mNGS数据处理中的GC偏好性。
在此研究中,常规细菌培养对病例6的微生物检测为阴性,但mNGS检测到的结果是病原菌混合感染,说明mNGS检测到的微生物种类组成包括微小微单胞菌、齿垢普氏菌、普雷沃氏菌、龈沟产线菌、牙龈卟啉单胞菌、星座链球菌、具核梭杆菌和福赛斯坦纳菌。其数据表明,在病例6中咽旁脓肿是由难以培养的微生物引起的,与传统的细菌培养相比,mNGS可以补充额外的结果来识别这些病原体,并指导临床医生选择治疗方法(图2F)。
在病例8中,mNGS发现的优势菌是柯氏棒状杆菌,但其基因组覆盖率只有44%(图2H),而在传统细菌培养检测中该菌的相对丰度很高,可能是因为mNGS检测中获得的微生物DNA读取数量有限,导致其整个基因组未完全覆盖。但是,从mNGS结果中获得的DNA片段读数在整个基因组中分布均匀(图2H)。此外,在这些样本的基因组中,相似的阅读特征部分证明了mNGS检测病原体的准确性和稳定性。
图2 mNGS检测到优势菌的深度和覆盖率
注:a-b. 病例1(a)和病例2(b)中的肺炎克雷伯菌检出。c-d. 病例3(c)和病例4(d)中的化脓性链球菌检出。e. 病例5中的脆弱拟杆菌检出。f. 病例6中的微小微单胞菌、咽峡炎链球菌、具核梭杆菌、福赛坦氏菌、咽峡炎链球菌、栖牙普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、龈沟梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的检出。g. 病例7中的大肠杆菌检测。h. 病例8中的柯氏棒状杆菌的检出。i. 病例9中的奇异变性杆菌的检出。深度是在重建序列中包含给定核苷酸的独特读取的数量,以参考基因组的1%为单位计算。覆盖率指测序获得的序列占整个基因组的比例。
Part 5 讨论
1. mNGS可快速诊断出细菌性脓肿的致病微生物,检出时间通常在24 h,比传统的培养诊断方法更快。也有很多研究表明,mNGS对临床样本中的微生物测定比传统的培养诊断方法具有更高的准确性。
2. mNGS相比于传统培养方法对混合病原菌感染的诊断更高效,但目前临床上利用mNGS对脓液中的病原体进行检测的研究却很少。在此研究中,研究者们发现mNGS在检测脆弱拟杆菌和奇异变形杆菌等挑剔的专性厌氧细菌引起的脓肿液病原体方面具有显著优势。此外,mNGS检测到的脓液中优势菌种均可视为临床致病菌,且与患者临床表现一致。
3. 在免疫功能低下患者的医学相关感染中常发现变形杆菌,本研究病例9患者因类风湿性关节炎而长期服用甲强龙,导致免疫力低下,进而引发变形菌感染。柯氏棒状杆菌在乳房脓肿和肉芽肿性乳腺炎患者中经常被发现,因此mNGS检测到的柯氏棒状杆菌可能是实验污染或定殖菌,需要考虑致病菌与病例临床表现的一致性。
结 论
mNGS对细菌性脓肿具有较强的病因学快速诊断能力,可直接反映机体各部位脓肿的形成和微生物的生态多样性,也可补充常规微生物方法所忽略的微生物种类
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