题目：优化后的宏基因组测序技术提高脑炎或者脑膜炎患者中的病毒检出

发表杂志：MBIO

发表时间：2021年8月

IF：6.784

DOI：10.1128/mBio.01143-21

 

研究背景

脑膜炎和脑炎是中枢神经系统（CNS）疾病的主要原因，被列为全球第四大损伤神经系统的疾病，常常导致严重的神经系统损伤或死亡。传统的诊断工作效率较低，并且需要病原体特异性诊断和连续的脑脊液（CSF）检测，有时还要进行侵入性手术。尽管有多种多样的诊断方式，但仍有40%-60%的脑膜炎或脑炎患者无法明确病因。

宏基因组测序（mNGS）通过高通量测序技术无偏倚的确定潜在的病原体。这项技术成功地检测了CNS感染患者的病原体，包括细菌、真菌、原生动物和病毒等。尽管目前还没有标准化，但是越来越多地被应用于临床诊断检测中。

 

研究对象

     本项研究，作者前瞻性地招募了68例已确诊或怀疑有中枢神经系统感染的患者，通过mNGS进行了RNA和DNA检测确认病原体。因为病毒是中枢神经系统感染中最常见的病原体，所以实验和分析都集中在病毒核酸检测上。

 

研究目的

     通过评估mNGS在识别中枢神经系统病原体的能力，以及加强实验室检测技术性能，来提高分析的灵敏度，其中包括病毒核酸杂交捕获（HC）和DNA甲基化去宿主技术（MDD)。

 

研究方法

1. 受试者登记及临床特征

对2016年4月到2017年12月马萨诸塞州综合医院（MGH）就诊的136名确诊或疑似CNS感染的成年人受试者进行了前瞻性脑炎和脑膜炎研究（PEMS），其中122人有脑脊液（CSF）。有CFS的患者中免疫功能正常但白细胞计数（WBC）＜5个/ul（n = 40）的患者被排除，因为这些患者是脑炎或脑膜炎的可能性很低。其他被排除的情况包括鼻腔细菌或无法通过mNGS区分的实验室污染的真菌和细菌（n = 14）。最终68名受试者被纳入mNGS分析。

2. 实验方法

对68名受试者收集CSF（n=68），血浆（n=5）和尿液样本（n=8）。工作流程如下，包括核酸制备，文库构建，测序，微生物鉴定，以及MDD和HC。

 

研究结果

1. 临床特征

     入组的68名成人患者有63%是男性，受试者年龄分布在24到86岁之间，其中25名是免疫力低下人群。根据临床检测，68名受试者中44人出院时得到了确诊；其中，12名受试者通过CSF样本PCR检测诊断为病毒感染（感染，CSF PCR+组），25名受试者通过血清学或血液PCR检测被诊断为感染（感染，其他组），还有7名受试者被诊断为非感染性疾病（其他诊断组）。其余24名受试者未得到明确诊断（未知组）（表1）。从不同分组上来看，”感染，CSF PCR+组”的临床感染疾病（ID）检测次数的中位数最低。同时，在整体队列中，”感染，CSF PCR+组”的住院时间（LOS）也是最短的，ID检测次数和LOS是有相关性的（图B）。

 

2. 来自mNGS和强化方法的结果

     作者对68份脑脊液、3份血浆、5份血清和12份尿液样本以及47例阴性对照进行了测序。对RNA、DNA或两者都进行了mNGS，平均每个受试者产生960万个reads。22名受试者（32.4%）中确定了病原体：18个使用mNGS，2个使用HC，2个使用MDD。与预期的那样，作者在“感染，脑脊液PCR+”组的大多数受试者中检测到病毒核酸（图3）。在评估强化方法时，作者发现在9个mNGS阳性病例中，HC增加了8个病例中病毒的reads，并且有时是大幅的增加。相比之下，MDD导致的结果好坏参半，在一些情况下能够检测到病毒，而在另一些情况下却不能（图4）。

 

3. mNGS检测传统CSF PCR未诊断的病原体

    "感染，其他组 "中，有25名受试者通过CSF、血清或血液PCR诊断为感染。15个受试者未经过CSF PCR检测；mNGS在6个样本中检测到病原体核酸，mNGS加HC的方法在第7个中检测到病原体，得到了7/15的阳性结果（47%）（图3）。另外10名受试者通过CSF PCR检测结果为阴性。虽然使用mNGS进行检测仍是阴性，但加入MDD后，在两个受试者中检测到VZV。这两个病例结果可以说明mNGS可能比PCR敏感性高。相比之下，MDD降低了对其他疱疹病毒的检出，表明病原体受到特异性的影响（图4）。

 

4. mNGS可检测出临床未检测到的病原体

24名未确诊（“未知组”）的受试者中，mNGS在3名受试者中发现了病毒，同时使用MDD和HC未检测到其他病原体。作者在两名患有淋巴细胞性脑膜炎的受试者中检测到了肠道病毒，他们都没有进行肠道病毒PCR检测。

5. mNGS可以检测到意义不明的病毒

除了上述可能的病原体外，作者还检测到了临床意义不确定的DNA病毒。4名受试者的CSF中存在低水平的EB病毒，其中3名受试者有其他的主要诊断：VZV、单纯疱疹病毒1和HSV-2。；第四名受试者没有其他诊断；然而，EBV仅在MDD和HC检测到，而且CSF PCR检测为阴性。回顾这些受试者的临床数据发现，EBV不符合临床症状，这些发现表明很可能实在一个急性期。

6. 非感染受试者的mNGS为阴性

7名非感染受试者中，mNGS没有检测到病原体核酸。("其他诊断组 ")：自身免疫性脑炎和小脑炎（n=3）、淋巴瘤（n=2）、脉管炎（n=2）。并且我们发现，这类患者的脑脊液中位WBC数比两个感染组患者低2-6倍；且CSF和血液的ID检测次数最多。这些受试者最终接受了免疫抑制剂治疗。

 

研究结论

1. mNGS技术能够恢复全部或者部分的病毒基因组，这表明了该技术在病毒特征研究中的实用性。

2. 与其他炎症CSF组相比，CNS感染使用CSF PCR诊断的受试者ID检测更少，而且住院时间通常较短；由此我们可以推断分子诊断技术的应用可能对病人治疗及费用上都会产生一个积极的影响，例如mNGS技术。

3. 本文结果还突出了强化的mNGS技术的好处。例如，在两个mNGS阴性的样本中，使用MDD加mNGS检测到VZV DNA。

4. 本研究的另一个优势是检测到了CSF PCR不能常规诊断的病原体，例如蜱虫传播的病原体Powassan病毒等。

总的来说，本文突出了mNGS的几个重要优势，包括在时效上比血清学更快，可以恢复病原体基因组数据，以及减少对特定检测诊断的依赖。目前是通过临床医生和mNGS专家之间的沟通，来评估mNGS所发现的病原体的合理性。作者建议未来可以将mNGS纳入临床诊断，实现对病原体的一步检测，为患者减少不必要的检测，降低治疗成本。

 

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