【文献速递】人工关节感染诊断中应用宏基因组测序技术的标本类型选择

发布时间：

2021-09-15

关节成形术后人工关节感染(PJI)率高达2%，病原体鉴定对于PJI患者的手术和治疗至关重要，诊断具有挑战性，尚有20%的PJI病原不明。宏基因组测序技术(mNGS)理论上可以检测到所有病原体，但在临床应用中，要实现更好的样本选择、采样时间选择和数据分析工具应用，还有很多工作要做。以往的回顾性研究证明可以应用单个样本进行mNGS检测来诊断PJI，已有在假体和滑膜液中识别病原体（包括传统方法难以检

题目：人工关节感染诊断中应用宏基因组测序技术的标本类型选择

作者单位：上海交通大学附属第六人民医院骨科

IF：5.082

期刊：THE BONE & JOINT JOURNAL

时间：2021.05

亮点：首次前瞻性分析了mNGS在PJI患者的三种不同类型样本中的诊断价值

研究背景

关节成形术后人工关节感染(PJI)率高达2%，病原体鉴定对于PJI患者的手术和治疗至关重要，诊断具有挑战性，尚有20%的PJI病原不明。宏基因组测序技术(mNGS)理论上可以检测到所有病原体，但在临床应用中，要实现更好的样本选择、采样时间选择和数据分析工具应用，还有很多工作要做。

以往的回顾性研究证明可以应用单个样本进行mNGS检测来诊断PJI，已有在假体和滑膜液中识别病原体（包括传统方法难以检测的病原体）的报道，目前还没有探讨如何选择样本的研究。mNGS是匹配和分析样本中所有的DNA(或RNA)片段，其结果取决于样本的类型、体积以及样本中人类DNA和病原体DNA的比例。PJI病原体鉴定通常需要几种不同类型的样本，包括滑液、假体周围组织和假体超声液，样本的选择非常重要。在进一步应用mNGS检测PJI病原之前，需要对其在不同类型样本中的诊断性能进行充分的探索。

本研究首次前瞻性地分析了mNGS在PJI患者三种不同类型样本中的诊断价值，以期选择最合适的样本和检测方法，用于使用多样本来检测病原体。

方法

用肌肉与骨骼感染学会(MSIS)人工关节感染诊断标准定义 PJI和无菌性松动(表1)。使用图1所示的纳入及排除标准筛选，最终59名患者的177个样本被纳入分析，包括术中取出的假体周围组织、滑液及假体超声液。所有样本分为两组，分别进行mNGS检测和培养。假体周围组织进行常规培养，包括需氧和厌氧细菌培养、真菌和抗酸杆菌培养。滑液和假体超声液采用BD-BACTEC-9120-9240型血液培养瓶培养，时间延长至14天。

表1 肌肉骨骼感染学会关于假体周围关节感染的标准

图1 患者流程图及标本的选择、分类和比较

研究结果

一、患者特点和假体周围关节感染类型

共有25名患者接受了全髋关节置换术(THA)，34名患者接受了全膝关节置换术(TKA)。19例(32.2%)接受了无菌翻修，7例(11.9%)接受了清创和植入物保留，5例(8.5%)接受了一期翻修(25.4%)，28例(47.5%)接受了二期翻修。最终，根据MSIS标准，40名患者(67.8%)为PJI，19名(32.2%)为无菌性松动(表2)。

表2 根据肌肉骨骼感染学会的标准，对患者的特点和假体周围关节感染进行分类

PMN：中性粒细胞；SD：标准差；WBC：白细胞

二、比较mNGS和培养的诊断性能（图2）

在所有样本类型中：

mNGS的敏感性为95.0%(38/40)，培养为85.0(34/40)。mNGS的特异性为94.7%，与培养一致。mNGS阴性预测值高于培养（90.0% vs 75.0%）。

在3种标本中：

假体超声液mNGS敏感性最高(92.5%)，其培养敏感性也是3种标本中最高的(85.0%)

滑液mNGS与培养相比，敏感性提高了22.5%，改善效果最好。

图2 mNGS和培养结果在总标本和不同标本中的分布情况

mNGS和培养结果比较：a：所有类型样本，b：假体周围组织，c：滑液，d：假体超声液

NPV：阴性预测值，PPV：阳性预测值

三、分析mNGS和培养结果的一致性

对于40例PJI，在所有类型的样本中，mNGS和培养结果一致和部分一致的样本在双阳性样本中占比超过九成，其病原体种类一致率为97.0%(32/33)，只有1例不一致，其中假体周围组织完全一致和部分一致样本为100%(14/14)，滑液为95.7%(22/23)，假体超声液为90.9%(30/33)。

mNGS在40例PJI样本中检测病原体种类的一致性显示了mNGS检测结果的可靠性，进一步反映了mNGS对不同类型标本中病原体的检测能力。在双阳性样本中，假体超声液有30例结果一致和部分一致，是三种标本中最多的。

在所有病例中，没有三种样本测序结果都不一致的情况。在部分一致的病例中(n=25)，至少有一种样本覆盖了三种类型样本中检测到的所有病原体。在最能反映诊断效果的部分一致病例中，假体超声液对所有病原体(单病原体和多病原体)的检出率最高，为76%(19/25)，其次是滑液，为56%(14/25)。

四、比较不同样本的测序性能（图3）

散点图显示了40个PJI中特定病例的序列参数。从基因组覆盖率(可能与检测到的病原体可信度相关)的角度来看，假体超声液检出病原体的平均覆盖率(13.7%)是假体周围组织(2.5%)和滑液(0.8%)的5倍，病原体平均测序读数 (5905.90reads)比假体周围组织(545.10 reads)和滑液(195.5 reads)高出10倍。三种样本相对丰度差别不大。

图3 不同标本的测序特征

a：覆盖率比较散点图，b：测序结果比较的散点图，

c：物种相对丰度测序比较散点图，d：三种类型标本的平均测序参数比较

五、mNGS和培养出的病原体分布（表3）

凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是PJI中最常见的两种病原体，mNGS与培养检出较一致，检测优势不显著 (p=1.00>0.05)。

mNGS检测链球菌具有显著优势， mNGS还能检测出培养难获得的病原体，如痤疮丙酸杆菌、支原体和病毒。总体而言，三种样本病原体检出率mNGS均高于培养。在3种样本中，假体超声液mNGS病原体检出病例数最高(84.6% (44/52))。

表3 mNGS和培养法检测三种样本中病原体

PSF：假体超声液；PT：假体周围组织；SF：滑液

*：所有类型的样本和所有检测方法中检测到相应病原体的病例数与检测到相应病原体的病例数之比

六、mNGS在不同患者中检测特征（表4）

在PJI前接受过抗生素治疗的9名患者中，8名患者mNGS能检测到病原体，而只有5名患者培养出病原体(表4)， mNGS和培养敏感性分别为88.9%和55.6%。

在31例未用过抗生素的患者中，mNGS和培养敏感性分别为96.8%和93.5%（无显著性差异(p=1.000>0.05)）。假体超声液的mNGS结果大多优于其他两类样本。

表4 接受和未接受过抗生素治疗的PJI患者mNGS与培养的检测特征

N/A，不适用；PSF：假体超声液；PT：假体周围组织；SF：滑液

七、mNGS和培养联合应用性能（表5）

三种类型样本联合应用mNGS和培养的敏感性为95.0%(38/40)，阳性率为最高（100%(52/52)）。对于mNGS联合单样本培养，假体超声液敏感性最高为95.0%，检出率最高为94.2%。然而，mNGS与培养联合应用并不明显优于单独使用假体超声液的mNGS敏感性（95%vs92.5%）

在临床应用中，假体超声液可能是单一样本mNGS检测的最佳选择。此外，mNGS与培养相联合应用可能优化病原体检测效果。

表5 不同样本类型mNGS和培养的联合应用

根据病例计算出检测到的病原体数量，PSF：假体超声液；PT：假体周围组织；SF：滑液

讨论

这项前瞻性研究采用严格的多样本平行对照方法，结果表明，假体超声液mNGS检测结果在大多数方面优于其他两种样本，可作为最佳样本选择。

滑液和假体周围组织的mNGS检测结果良好，敏感性比培养法高出近20%。假体周围组织在翻修关节成形术中容易获得，在三种类型样本中特异性最高（100%(19/19)）。

非靶向mNGS在替代PJI传统检测方法之前仍有一些短处，如成本高、缺乏关于病原体信息的深度、定植与感染的区分及其应用的标准化。然而，我们发现mNGS在临床管理的几个实际方面可以显著提高病原体的检出率，如在接受过抗生素治疗的PJI患者中检测罕见病原体。综合考虑时效性(少于48小时)、不需预设、检测全面性的优势，在临床中可选择适当样本与mNGS技术相互配合使用。

本研究使用了三种类型样本，有助于改进mNGS技术的处理和分析，使其在患者的病原体鉴定中得到深入的应用。

结论

mNGS作为一种准确的诊断工具，可检测PJI患者三种不同类型样本中的病原体，具有优越的诊断性能。与其他类型样本相比，假体超声液在mNGS中发挥了更大的作用，并有可能部分取代传统检测方法（如培养）。

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