【文献速递】铜绿假单胞菌基因组与耐药表型关联研究

发布时间：

2021-09-15

近年来，铜绿假单胞菌广泛耐药的特点为临床治疗提出了严峻挑战。本研究通过对390株分离自2003-2012年不同地区的铜绿假单胞菌进行全基因组测序，并与美罗培南、左氧氟沙星和环丙沙星的药敏表型数据进行关联分析，揭示了ST111(主要为O12血清型）和ST235(O11血清型）亚群富集了较多多重耐药的β内酰胺基因。证明了利用NGS技术挖掘复杂耐药机制的可行性，为后续临床感染诊断和治疗奠定了基础。

文章题目：铜绿假单胞菌基因组与耐药表型关联研究

发表杂志：《AntimicrobAgents Chemother》

发表时间：2014年7月

影响因子：5.194

作者：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆阿斯利康研发中心感染创新药物部门和拉瓦尔大学传染病研究中心

文章亮点：基于基因组数据挖掘耐药表型相关特征

研究背景

铜绿假单胞菌是一种重要的院内感染菌，革兰氏阴性菌，它是造成囊性纤维化(CF)的主要原因，也是造成ICU感染的TOP3重要病原菌。近年已有报道表明铜绿假单胞菌对越来越多的抗生素耐药，包括“第四代”头孢菌素。在美国、欧洲、和南美洲均有报告高水平的β-内酰胺铜绿耐药菌，目前只有粘菌素、阿米卡星等对多重耐药的假单胞菌表现出良好的活性。总之，由于铜绿先天性和获得性耐药等复杂机制对临床治疗产生重大挑战，急需更加快速鉴定耐药表型方法。已报道NGS可从基因水平在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌等病原菌上进行耐药表型预测，但对铜绿基因型与耐药表型的关联分析有待研究。

研究目的

基于NGS方法分析390株铜绿假单胞菌种群多样性及基因水平的耐药机制，并进一步从基因水平上来解释耐药机制。

研究方法

收集来源于美国健康管理协会（IHMA）的390株铜绿假单胞菌菌株，并进行药敏表型和血清型实验。基于IlluminaHiSeq2000平台和MiSeq平台进行二代测序及组装。并从NCBI公共库下载15株铜绿假单胞菌基因组序列，与本研究菌株一起进行进化树分析。对上述基因组进行MLST分型（www.pubmlst.org）及耐药基因注释（自主构建的耐药数据库）。

结果

1、构建了多样性较高的铜绿假单胞菌菌基因组种群

本研究使用的铜绿种群分离时间广、跨度大，且进化树上处于各个分支，多样性高。从基因组大小上看，介于6-7.4Mb之间，基因组大小与不同亚群有关。除了囊性纤维化(CF)分离株外，不同亚群与菌株的分离部位无明显关联（图1）。同时，MLST结果也显示物种多态性高且不同地区基因型也有较大的差异（图2）。血清型覆盖了主要的O血清型菌株，以O11和O12血清型为主。

图1

图2

2、以整合子形式存在的β内酰胺耐药基因分布较广

经过耐药基因分析，超过120例菌株检出了I型整合子结构（如intI1- aacA7 - VIM-2 - dfrB5 - aac(3)-Ie -tniR），且很多整合子中携带了β内酰胺酶（A类、B类、D类），覆盖了重要家族包括VIM,IMP,OXA等。发生率最高的三个基因型分别为VIM-2(23株），OXA-2(22株），PSE-1(13株）。同时，结合地理位置信息及进化树结果，进一步展示了这些β内酰胺酶基因与地理分布及种群之间的关系（图3），大部分β内酰胺酶基因主要位于ST235和ST111亚群，同时通过耐药基因数目与地理位置关系间接提示该地区抗生素管理使用的规范程度。

图3

3、耐药基因与药敏表型关联分析结果

美罗培南耐药分析：有报道OprD基因的变异降低了铜绿对美罗培南的摄取能力，本研究样本中OprD变异主要集中于loop7位点。根据OprD的变异特点，由基于进化树可知，PAOI所在分支为OprDI型，LESB58所在分支为OprdII型。在全部样本中172株（44.3%）对美罗培南耐药，携带KPC-2,VIM-2的菌株仅为少数，其中143株发生了OprD变异。共29例样本的美罗培南耐药或敏感表型无法通过OprD是否变异和β内酰胺酶基因的有无来解释，如某样本检出了IMP-13但为美罗培南敏感，有15例样本未检出oprD变异和β内酰胺酶基因但却为美罗培南耐药，可能为外排泵基因或调控原件变异作用导致，如MexAB-OprM,MexXY-OprM, MexZ等（图4）。

左氧氟沙星耐药分析：有文献报道gyrA、gyrB、parC、parE为喹诺酮类重要耐药基因元件（QRDRs），全部样本中有198例样本对左氧氟沙星耐药，190例对左氧氟沙星敏感。其中163例样本检出了gyrA基因变异。GyrA(T83I)和ParC(S87L)为最主要的QRDRs。3例耐药株样本检出了gyrB和parE变异。在敏感株中检出了上述基因的部分变异，包括gyrA(G81D)，gyrB(S466F)，parE(S87L)等，这些变异或与耐药机制无关（图4）。

阿米卡星耐药分析：全部样本中，有105个样本为阿米卡星耐药株，283个样本为阿米卡星敏感株。已有报道显示氨基糖苷类耐药常常与氨基糖苷类修饰酶AMEs获得性耐药相关。本研究耐药株中检出AMEs包括ant(4’)-IIb,aph15, aph(3’)-VIb, aph(6)-Id, aac(6’)-Ib, aac(6’)-Iai,aac(6’)-31, aacA29,aacA7, RMT-encodingrmtD等。此外，外排泵也是氨基糖类重要的耐药机制，本研究24例耐药样本检出了完整的MexXY-OprM调控元件MexZ结构。耐药基因的检出与地理位置呈现一定相关，如有50%的aph(6)-Id阳性样本都分离自阿根廷。（图4）

粘菌素耐药分析：在全部样本中有两个样本为粘菌素耐药，有报道粘菌素耐药与PmrAB和PhoQS的相关，但本研究两例耐药样本未检出这两个基因相关变异。

图4

结论

近年来，铜绿假单胞菌广泛耐药的特点为临床治疗提出了严峻挑战。本研究通过对390株分离自2003-2012年不同地区的铜绿假单胞菌进行全基因组测序，并与美罗培南、左氧氟沙星和环丙沙星的药敏表型数据进行关联分析，揭示了ST111(主要为O12血清型）和ST235(O11血清型）亚群富集了较多多重耐药的β内酰胺基因。证明了利用NGS技术挖掘复杂耐药机制的可行性，为后续临床感染诊断和治疗奠定了基础。

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