【文献速递】台湾非mcr粘菌素耐药大肠杆菌的耐药机制：PmrA中R81H替换是影响粘菌素耐药的独立因素

发布时间：

2021-09-15

粘菌素是一种以革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)为目标的阳离子抗菌肽，被认为是治疗碳青霉烯耐药肠杆菌科(CRE)感染的最后一种药物之一。。为了进一步表征大肠杆菌染色体介导的粘菌素耐药机制，本文目的是研究非mcr粘菌素耐药大肠杆菌的耐药机制，研究了来自TSAR（台湾抗菌素耐药性监测）的携带粘菌素耐药基因的大肠杆菌分离株的分子流行病学和耐药机制。

发表时间：2021年7月

影响因子：7.171分

作者：台湾国防医学中心医学科学研究生院

文章亮点：PmrA中的R81H氨基酸替换是非mcr大肠杆菌中粘菌素耐药的独立因素

研究背景

粘菌素是一种以革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)为目标的阳离子抗菌肽，被认为是治疗碳青霉烯耐药肠杆菌科(CRE)感染的最后一种药物之一。由于粘菌素使用的增加，肠杆菌科对粘菌素已在全球范围内产生耐药性。针对粘菌素的主要获得性抗性机制涉及质粒或染色体介导的LPS修饰，从而降低LPS与带正电荷的粘菌素间的静电亲和力，最终触发细菌表现出粘菌素耐药性。目前，已有研究报道大肠杆菌染色体介导的粘菌素耐药机制，但关于耐药大肠杆菌的流行率和分子流行病学研究较少。为了进一步表征大肠杆菌染色体介导的粘菌素耐药机制，本文研究了来自TSAR（台湾抗菌素耐药性监测）的携带粘菌素耐药基因的大肠杆菌分离株的分子流行病学和耐药机制。

研究目的

目前尚未报道非mcr粘菌素耐药大肠杆菌的分子流行病学和耐药机制，本文目的是研究非mcr粘菌素耐药大肠杆菌的耐药机制。

研究方法

2008年至2018年，在7942株（0.1%）临床大肠杆菌中，共鉴定出11株非mcr粘菌素耐药菌株，其患病率很低，并在研究期间保持稳定。自2012年以来，出现了具有多种耐药表型的ST131和ST1193克隆。所有耐药菌株的操纵子pmrHFIJKLM和pmrCAB的表达水平均高于对照组的MG1655菌株。虽然在PmrA或PmrB中发现了一些氨基酸替换，但在PmrA中只有R81H与pmrHFIJKLM的过表达和粘菌素耐药性相关。互补实验证实了PmrA中R81H对粘菌素抗性的影响。虽然一些菌株在PmrB中存在替换，但已鉴定出的PmrB突变并没有促进粘菌素抗性。首次证明了PmrA中的R81H氨基酸替换是非mcr大肠杆菌中粘菌素耐药的独立因素。该研究结果有助于深入了解大肠杆菌中染色体编码粘菌素抗性的多样性和复杂性。

结果

1 大肠杆菌中非mcr粘菌素耐药性的流行率和特征

筛选非mcr菌株共11例，使用该11株分离株作为供体，将大肠杆菌J53作为受体进行偶联试验显示，没有在Mueller-Hinton琼脂平板上发现含有粘菌素(4mg/l)和叠氮化物(500mg/l)的转接合物。表明11株大肠杆菌的粘菌素耐药机制可能是由染色体而不是质粒介导的。表1总结了已鉴定菌株的特征。

表1

11株菌株粘菌素的MIC范围为8~16mg/l，3株含有CTXM型β-内酰胺酶(TSAREC07的blaCTX-M-G1，TSAREC08和TSAREC37的BlaCTX-M-G9)。2008年至2012年，分离株属于不同序列类型(STs)，但ST131和ST1193已成为分离株中的主要STs。脉冲场凝胶电泳(PFGE)显示，ST131大肠杆菌菌群的PFGE模式具有80%的相似性，而其他菌株则属于不同的脉冲型（图1）。

图1

2 pmrD基因、pmrCAB操纵子和pmrHFIJKLM操纵子在粘菌素耐药大肠杆菌菌株中的表达水平

将鉴定的粘菌素耐药大肠杆菌株中pmrD、pmrC和pmrK基因的表达水平与野生型MG1655株进行比较（表3）。所有粘菌素耐药菌株的pmrC和pmrK基因的表达水平均显著升高。对于pmrD的表达水平，所有粘菌素耐药株的表达水平均未增加。

表3

3 粘菌素耐药大肠杆菌菌株中PmrAB和PmrD的氨基酸替换

MG1655中pmrA、pmrB和pmrD基因的序列和8株粘菌素敏感菌株(ECS01~ECS08)进行序列比较，发现粘菌素耐药大肠杆菌菌株中PmrD的所有氨基酸替换均发生在粘菌素敏感株中。经比较后，粘菌素耐药菌株仅在PmrA和PmrB中产生的氨基酸替换见表3。利用蛋白变异效应分析仪(provean)和不耐受(SIFT)软件分析，预测PmrA中R81H的替换和PmrB中G19E、L27P、L194P、L98R和P94L的替换会影响这些基因编码的蛋白功能。

4粘菌素耐药菌株中PmrAB中氨基酸替换的作用

通过互补实验进一步研究了粘菌素耐药菌株中pmrA和pmrB的变化作用。用含有突变的pmrA等位基因的重组质粒对菌株MG1655_∆pmrA（pCRII-TOPOpmrAg242a）进行转化后，菌株对粘菌素产生抗性（MIC=8mg/L），pmrK表达显著增加（相对于MG1655变化17.12±4.23倍）（表4和图2A）。此外，另一补体菌株MG1655_∆pmrA（pCRII-TOPOpmrAWT）经野生型PmrA转化后仍对粘菌素（MIC=0.5mg/L）敏感，pmrK的表达水平为MG1655的1.52±0.18倍。综上所述，pmrA基因中的R81H突变赋予了大肠杆菌粘菌素抗性。而转化不同pmrB突变蛋白的互补菌株的粘菌素MIC无变化，因此，在这些对粘菌素耐药的大肠杆菌菌株中鉴定出的突变的pmrB基因可能对粘菌素的耐药性无关。

表4

图2

结论

本文首次证明了PmrA中的氨基酸取代R81H是非mcr大肠杆菌中粘菌素耐药的独立因素。该研究结果有助于深入了解大肠杆菌中染色体编码粘菌素抗性的多样性和复杂性。

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