导读

 

　　16S扩增子测序、metagenomics测序等不依赖于培养的技术手段的发展极大推动了微生物组学研究，之前被认为无菌的肺部实际上存在着复杂、动态变化的细菌群落。进一步探究发现，危重病人肺部微生物群相比正常个体发生了意义深远的改变，此种变化可能加重肺泡炎症并延长炎症持续的时间，但对于肺部微生物群与危重病人临床预后的关系一直未有结论。密西根大学医学院肺科和重症学科Robert P. Dickson教授及其团队，近期于American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine杂志上发表了危重病人肺部微生物群与临床预后的相关性研究，证实对于机械通气危重症患者，入院时肺部微生物群的两大特征——细菌载量(bacterial DNA burden)和菌群组成(community composition)——可指示病程发展，具体来说肺部细菌DNA含量增加及肠道相关细菌类群(Lachnospiraceae 和Enterobacteriaceae科)的富集预示不良临床预后和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的发生，支持了先前"肠道菌向肺部转移是肺损伤病因之一"的假说。此项研究强调了针对危重病人检测肺部微生物群的重要临床意义，肺部微生物群作为一个重要但未被充分认识的临床异质性的来源，解释了临床表征相似的病人病情发展的差异，提示针对肺部微生物群的干预、调控或可成为危重病人潜在治疗方案。

 

　　英文题目：Lung Microbiota Predict Clinical Outcomes in Critically Ill Patients ^[1]

 

　　中文题目：肺部微生物群可预测危重病人的临床预后

 

　　发表期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (IF 16.494)

 

　　发表时间：2020年1月

 

　　作者及单位：Dickson R P, Schultz M J, van der Poll T等，密西根大学医学院肺科和重症医学部

 

　　材料与方法

 

　　此项前瞻性观察队列研究以进入ICU的机械通气危重病人为研究对象，患者进入ICU后24小时内，通过微支气管肺泡灌洗法收集支气管肺泡灌洗液样本，对共计91例危重病人样本利用细菌16s rRNA基因测序和微滴数字PCR两种技术对肺部微生物群进行定性和定量分析，用以确定危重病人肺部微生物群变化与临床预后的关系。预测指标包括细菌载量、菌群多样性和菌群组成三大特征，将上述三项预测性指标与进入ICU后28天内无呼吸机天数进行关联分析，同时还分析了ARDS患者相比非ARDS患者，肺部菌群组成的特点。

 

　　主要结果

 

　　1.1 危重病人肺部标本的微生物群区别于对照组的测序背景

 

　　DNA提取及测序文库构建等实验试剂中可能存在细菌DNA，使得聚焦低生物量的微生物组学研究需要尽量排除污染对于研究结果的干扰。此项研究选择低微生物量的部位(下呼吸道)进行取样，小体积标本(mini-BAL)，核酸提取前利用离心去除真核细胞，在样本收集环节确保提取的核酸主要来源于肺部细菌DNA。

 

　　为了验证mini-BAL样本能否检测到不同于对照的细菌信号，研究人员设置了包括无模板对照(N=25)、AE缓冲标本(N=8)、用于DNA提取的无菌水(N=4)、提取对照样本(N=9)和空白测序孔(N=6)在内共5组阴性对照。利用液滴数字PCR技术对细菌16S基因进行超敏定量发现mini-BAL样本中细菌DNA明显多于无模板对照标本。而利用16s扩增子测序技术分析细菌群落，进一步证实mini-BAL标本中检测到的细菌明显异于阴性对照：主成分分析表明，区别于阴性对照，mini-BAL很好的聚类，仅有部分mini-BAL与阴性对照有重叠;丰度分析显示，阴性对照和mini-BAL两者间细菌类群的相对丰度存在明显差异，以阴性对照中占比25.5%的优势菌群OUT008: Pelomonas为例，其在mini-BAL中占比仅为2.6%。

 

　　以上结果表明，尽管mini-BAL样本间细菌DNA含量差异较大，且存在外源污染的可能性，但是仍然能够检测到不同于阴性对照、特异的细菌信号。

 

　　图1. mini-BAL样本与阴性对照样本检测到的不同的细菌信号

　　Fig1. Evidence of distinct bacterial signal in mini-bronchoalveolar lavage specimens compared to negative control specimens.

 

　　1.2 ARDS危重病人肺部菌群发生改变，检测到肠道相关菌群的富集

 

　　先前研究表明ARDS患者肺部微生物群存在肠道相关细菌富集的现象，本研究也期望通过与非ARDS危重患者比较，揭示ARDS患者肺部细菌的相关特征。如图2所示，与无ARDS患者相比，ARDS患者肺部细菌DNA载量更高，而Shannon Diversity Index和Community richness两项分析显示两者在菌群多样性方面无显著差异。

 

　　进一步聚焦菌落组成，首先主成分分析直观地展示了两组样本虽然存在较多的分类学上的重叠，但不可否认仍存在各自分离聚群的趋势;利用mvahund也在统计学上证实菌群组成存在差异，基于分类学水平的比较得到完全一致的结论;通过biplot分析鉴定两组各自特异性的菌种组成，结果显示无ARDS患者以常见于健康个体的肺部菌群(Streptococcaceae spp., Veillonellaceae spp., Prevotellaceae spp.)以及阴性对照样本中发现的菌群(Verrucomicrobiaceae spp., Flavobacteriaceae spp.)为主，而ARDS样本主要特征群为Pasteurellaceae spp 和Enterobacteriaceae spp。通过对ARDS和非ARDS患者优势菌群的相对丰度进行排序(图2E)，可以看出虽然两组间有很多相同的分类单元，但ARDS患者肺部肠杆菌科含量显著高于非ARDS患者(ARDS患者中肠杆菌科占菌群测序序列的12.5%，而在非ARDS患者中仅为0.18%)。使用基于无偏回归(mvahund)和ensemble-learning(随机森林)两种分析方法鉴定得到的ARDS患者中显著富集的细菌类群均为肠杆菌科。与已发表的另外一项研究结果进行对比分析时发现，本次研究鉴定出的丰度最高肠杆菌科(OTU0005，占所有肠杆菌分类序列的61.5%)与Panzer等人公布的与ARDS相关的肠杆菌科(OTU2119418)的代表性序列一致性高达96%，仅有3个碱基对不同。将与ARDS相关的OUT，在SILVA核糖体RNA数据库找到匹配度最高的前20个序列，根据数据库里找到的邻近OTUs的注释信息来看，证实上述两个OUT特异性地归于肠杆菌纲分类单元，包括Escherichia coli、Enterobacter spp.和Klebsiella Pneumoniae。综上，ARDS患者肺部微生物群不同于非ARDS危重病人，主要表现为肠道相关菌群Enterobacteriaceae spp的富集。

 

　　图2. ARDS患者肺部微生物群发生改变

　　Fig2. Lung microbiota are altered in patients with the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS).

 

　　1.3 肺部微生物群可以预示危重病人临床预后

 

　　为探究mini-BAL标本的细胞载量(通过ddPCR对16S rRNA基因进行定量)能否预测ICU病人的预后，研究人员利用单变量分析，发现无论是连续变量还是分类变量分析，基线时患者的肺部细菌DNA载量增加都对应更短的无呼吸机天数。换言之，肺部细菌DNA每增加10倍，理想预后(脱离机械通气)的HR风险比为0.43。而与低细菌载量的患者相比，基线时肺部细菌DNA载量处于上三分位值的患者在7、14、21和28天呼吸机停用和个体存活的可能性更小。

 

　　考虑到肺炎在机械通气患者中很常见，且是干扰肺部细菌群研究结论的潜在因素，因此本研究还对27位初步判定肺炎患者、以及其中7位复查符合CDC对疑似或确诊肺炎诊断标准的患者分别进行了深入分析。即便控制了肺炎这一变量，无论是HR值还是模型的显著性都未发生明显改变，患者是否存在肺炎并不会影响肺部细菌DNA载量对预后的预测能力。随后研究人员利用多因素分析，在控制了年龄、性别、疾病严重程度(APACHE IV评分)、是否疑似肺炎和有无ARDS等变量后，证实肺部细菌DNA载量，仅此一项指标即可预测临床预后。

 

　　随后，探究了肺部细菌的多样性能否预测ICU危重病人的临床预后，结果显示，肺部细菌多样性(shannon多样性指数)与ICU预后关系并不明确。基线时肺部细菌多样性高的患者获得了最理想的ICU治疗效果，而菌群多样性较低的患者治疗结果次之，但差异未达到统计学显著性。其他肺部细菌多样性指标(菌群丰富度、菌群优势度)也不能显著预测ICU结局。最后研究了肺部细菌的群落组成是否可以预测ICU危重病人的预后。使用mvabund(基于模型的多因素丰度数据分析法)比较了患者无呼吸机天数与基线时肺部细菌群落结构的关系，发现基线时肺部整体的细菌群落构成可以显著预测病人无呼吸机天数;使用随机森林鉴定与不良预后相关的分类单元，发现与肠道相关的Lachnospiracaeae和Enterobacteriaceae与无呼吸机天数间的关系最紧密。反过来验证这些分类单元预测不良临床结局的效果，如图4B所示，检测到Lachnospiracaeae的患者对应不良预后，而Enterobacteriaceae与无呼吸机天数的关系不显著。

 

   综上，危重病人肺部微生物群中细菌载量和菌落组成(特别是肠道相关菌群的富集)可以预测预后情况。

 

　　

　　图3. 肺部细菌载量可以预测机械通气危重患者28天内的临床预后

　　Fig3. The burden of bacterial DNA detected in mini-BAL specimens was predictive of total ventilator-free days.

 

　　图4. 肺部细菌的多样性与无呼吸机天数关系不显著，但菌落结构可以预测无呼吸机天数

　　Fig4. Community diversity of lung bacteria did not significantly predict ventilator-free days, while community composition of lung bacteria was significantly predive of ventilator-free days.

 

　　结论

 

　　本研究首次证明肺部微生物群的变化可用于预测危重病人的临床预后，这一关键发现与早先很多非ICU患者肺部微生物组研究结论一致，肺部微生物群同样可以预测肺纤维化^[2-3]、慢性阻塞性肺疾病^[4]、支气管扩张^[5-6]和呼吸道感染易感婴儿^[7]的疾病进展。虽然这些研究在不同疾病背景下证实了肺部微生物群是疾病进展的一个关键因素，但肺微生物群能否被干预、调节，并作为减轻肺部损伤、治疗相关疾病的潜在治疗方案，仍然未知。使用无菌和抗生素暴露的小鼠进行动物实验，发现改变微生物组确实会影响宿主对肺部炎症、损伤的易感性和死亡率，但是肺部微生物在急性和慢性肺损伤发病机制所发挥的作用还有待研究，未来研究需要进一步探讨微生物组在肺部疾病中发挥的作用是通过远端(肠道-肺)宿主-微生物间的互作来实现还是改变只是局限在肺部病灶。

 

　　参考文献

 

1. Dickson R P, Schultz M J, van der Poll T, et al. Lung microbiota predict clinical outcomes in critically ill patients[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2020, 201(5): 555-563.

2. Molyneaux P L, Cox M J, Willis-Owen S A G, et al. The role of bacteria in the pathogenesis and progression of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2014, 190(8): 906-913.

3. O'Dwyer D N, Ashley S L, Gurczynski S J, et al. Lung microbiota contribute to pulmonary inflammation and disease progression in pulmonary fibrosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 199(9): 1127-1138.

4. Leitao Filho F S, Alotaibi N M, Ngan D, et al. Sputum microbiome is associated with 1-year mortality after chronic obstructive pulmonary disease hospitalizations[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 199(10): 1205-1213.

5. Sibila O, Laserna E, Shoemark A, et al. Airway bacterial load and inhaled antibiotic response in bronchiectasis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 200(1): 33-41.

6. Rogers G B, Zain N M M, Bruce K D, et al. A novel microbiota stratification system predicts future exacerbations in bronchiectasis[J]. Annals of the American Thoracic Society, 2014, 11(4): 496-503.

7. Bosch A A T M, Piters W A A S, van Houten M A, et al. Maturation of the infant respiratory microbiota, environmental drivers, and health consequences. A prospective cohort study[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2017, 196(12): 1582-1590.

 

　　关于金匙医学

 

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