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文献分享:适用于病毒诊断及基因组监测的加标引物富集宏基因组测序方法

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  • 来源:
  • 发布时间:2020-05-06 18:38
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【概要描述】

文献分享:适用于病毒诊断及基因组监测的加标引物富集宏基因组测序方法

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   一、基本信息简介

 

   1.文章标题:Metagenomic sequencing with spiked primer enrichment for viral diagnostics and genomic surveillance

 

   2.作者:Xianding Deng1,2, Asmeeta Achari1,2, Scot Federman1,2 et al.

 

   3.作者单位:Department of Laboratory Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USAUCSF– Abbott Viral Diagnostics and Discovery Center, San Francisco, CA, USA

 

   4.杂志情况:Nature microbiology . Published online March 9, 2020.

 

   5.IF: 14.3

 

   二、内容概述

 

  事实证明宏基因组技术在广谱致病菌检测及疫情爆发的基因组监测中具有重要作用。然而,对于低丰度致病菌的感染,靶向扩增技术是提高致病菌检测灵敏度的必要步骤。现在常见的PCR技术及捕获探针技术因高成本、复杂的操作流程、交叉污染等原因,限制了其技术的应用。本研究建立的一种靶向富集RNA病毒的方法,即加标引物富集技术(Metagenomic sequencing with spiked primer enrichment MSSPE),该技术可以保留其它致病菌的检测灵敏度不受影响的同时,提高目标菌株的检测灵敏度。

 

   1.样本情况

   1)样本类型:塞卡病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、登革热病毒等14种病毒的培养物以及临床阳性血浆,病毒检测为阴性的血浆作为对照。2)检测方法:实时定量标准曲线分析测定待测样本的病毒载量。通过作者开发的自动算法,根据每个菌种的参考基因组,设计引物序列,于宏基因组反转录过程中加入引物探针,对目标菌种进行富集。针对ZIKV样本,文中使用捕获及多重PCR的富集方法与MSSPE进行对比,以评价MSSPE方法的灵敏度和准确性。

 

  MSSPE引物设计流程

 

  MSSPE宏基因组建库流程

 

   2.研究策略

 

   本文公布了一种新的病毒富集方法,并通过与传统方法MSSPE(多重PCR扩增技术、探针捕获技术)对比,评价了该方法的应用价值。

 

   3.研究结果

 

   1)研究基于illumina及nanopore测序平台,测试了不同引物panel在不同引物浓度下,目标菌株富集情况。65例培养样本以及27例临床阳性样本在不同拷贝数浓度下,使用MSSPE富集后,发现低于10cp/ml的培养样本以及低于100cp /ml临床阳性样本的富集倍数均值均显著高于其它浓度。

 

   且研究证明MSSPE方法可以应用于illumia和nanopore测序平台,不同病毒的最低检出浓度不同。其中naopore测序平台因测序错误导致barcode拆分错误,引起了假阳性。

 

   2) 实验证明,MSSPE捕获后,可以有效提升病毒的基因组覆盖度。但病毒浓度低于10 cp ml−1时,效果不明显。此外,经测试,MSSPE富集菌株后,可以正确的组装病毒基因组,表明MSSPE技术具有监测疫情爆发时病毒基因组变异的能力,不会因为共有基因组而导致组装偏差。

 

 

   3) MSSPE技术与多重PCR及捕获技术相比,多重PCR和捕获技术能够检测到临床阳性样本中低拷贝数浓度的样本,MSSPE技术检出的覆盖度较有优势,但多重PCR和捕获技术重复reads占比高,且引入其他的污染。

 

   4.研究结论

该研究评估了14种不同病毒的MSSPE,产生了中位数十倍的富集效果,并且与普通mNGS流程相比,基因组覆盖范围平均增加了47%(±16%)。MSSPE检测病毒的特异性与多重PCR法相当,检测受感染患者血浆样品中的寨卡病毒、埃博拉病毒、登革热、基孔肯雅热和黄热病病毒的准确性达到95%。值得注意的是,MSSPE成功地富集了Powassan和Usutu的再生或共感染的病毒序列。SSPE方法简单、成本低、快速,并且可部署在台式或便携式纳米孔测序仪上,从而使该方法直接应用于诊断实验室。

 

   三、讨论关键点

 

  问题:如何快速、低成本、无偏好提高宏基因组检测低浓度致病菌的灵敏度?

 

  发现:本研究提出了一种新的快速、低成本、无偏的致病菌富集方法:MSSPE。该方法可以通过对多种致病菌进行探针引物设计,在无特殊外源菌引入以及不增加实验难度的情况下,完成目标菌株富集,为疫情爆发情况下,监测低浓度致病菌的基因组变异情况提供了尝试思路。

 

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