【文献速递】血浆mcfDNA测序在ICU脓毒症诊断中的应用
脓毒症是重症监护病房(ICU)中常见的危及生命的疾病，约占住院期间死亡人数的三分之一，需及早诊断治疗，降低死亡率。传统培养方法是检测脓毒症病原体最常见的方法，但阳性率只有30-40%。因此迫切需要一种理想的诊断方法，能够在多器官功能障碍综合征(MODS)发生之前快速确定病原并指导治疗。本研究中，血浆mcfDNA检测脓毒症的灵敏度为68.1%，比血培养高出约28%，血浆mcfDNA测序诊断脓毒症的特异性低于血培养(64.0%vs.82.6%)，假阳性可能是粘膜屏障受损或免疫抑制造成的，特别是在癌症患者和移植受者中。该研究显示，重症肺炎并发血流感染的可能性很大。最近大量证据表明，血流感染是重症肺炎预后恶化的重要预测因子，早期识别重症肺炎患者的脓毒症或血流感染有助于精确治疗。
文献信息
文献题目：血浆mcfDNA测序在ICU脓毒症诊断中的应用
发表时间：2021年5月
IF：4.188
01. 研究背景
脓毒症是重症监护病房(ICU)中常见的危及生命的疾病，约占住院期间死亡人数的三分之一，需及早诊断治疗，降低死亡率。经验性使用抗生素的准确性不尽人意，还导致了抗生素的广泛使用。对于培养结果阴性的脓毒症患者，准确识别病原体仍然是一个挑战。
传统培养方法是检测脓毒症病原体最常见的方法，但阳性率只有30-40%。因此迫切需要一种理想的诊断方法，能够在多器官功能障碍综合征(MODS)发生之前快速确定病原并指导治疗。
血浆mcfDNA发现于上世纪，是死亡细胞和定植或入侵的微生物分解时释放到血液中的核酸。本研究比较了血浆mcfDNA测序和血培养对ICU脓毒症患者的诊断性能，以验证血浆mcfDNA测序是否是监测和预测感染性疾病的一种有效方法。
02. 研究方法
本项前瞻性研究的对象是2020年1月至2020年6月在上海东方医院ICU住院的疑似血流感染(BSI)患者。根据专家的最终诊断，患者分为感染性疾病组(ID组)和非感染性疾病组(NID组)。感染性疾病组分为脓毒症组和非脓毒症组。血液样本同时做血培养和血浆mcfDNA测序，此外还进行了其他检测，包括涂片，感染部位样本培养和β-D-葡聚糖/半乳甘露聚糖(BDG/GM)试验等。
03. 结果
患者和样本特征
共纳入199例患者，男性占64.8%，ICU平均住院天数为13天，住院28天死亡率为27.6%，ID组181人（图1）。BSI（47.2%)是首要病因，其次是下呼吸道感染(LRTIs)。
非脓毒症组（87人）中，LRTIs最常见病因 (78.2%)，其次是泌尿系感染(UTIs) (16.1%)和腹腔感染(IAIs) (14.9%)（图2）。此外，11例患者多次连续检测(采样≥3次)，8例诊断为脓毒症。
图1 研究流程图
图2 本研究中脓毒症组和非脓毒症组的分布情况
BSI：血液感染；CVSI：心血管系统感染；LRI：下呼吸道感染；SSTI：皮肤软组织感染；UTI：尿路感染；IAI：腹腔感染；CNSI：中枢神经系统感染。
比较血浆mcfDNA测序与血培养结果
1、脓毒症与非脓毒症的诊断性能
脓毒症组（94人）中，64例至少1种微生物结果阳性，细菌最常见，58例至少检出一种细菌。
两个组测序阳性率均显著高于血培养(p<0.01)（图3A）。测序诊断脓毒症的PPV为66.7%，NPV为64.7%，敏感性显著高于血培养法(68.1%vs.40.4%，p<0.01)，特异性显著降低了约20%(63.2%vs.82.8%，p<0.01)（图3B）。
图3 比较脓毒症组与非脓毒症组血浆mcfDNA测序及血培养的诊断性能
NPV：阴性预测值；PPV：阳性预测值；pos：阳性；neg：阴性
2、血浆mcfDNA测序与血培养相关性和一致性
199例患者中，41例(20.6%)测序和血培养均为阳性，16例检测到的病原体完全一致，12例完全不一致，13例部分一致（至少共检出一种病原体）（图4），87例(43.7%)均阴性。59例(29.6%)仅测序阳性，12例 (6.0%）仅培养阳性。非脓毒症组，测序到的微生物可能不是脓毒症病原。
图4 血浆mcfDNA测序与血培养结果相关性和一致性
3、抗生素使用对检测结果的影响
抗生素使用率较高(144/199，72.4%)。
未使用抗生素患者中(n=55)，测序阳性率和血培养阳性率没有明显的差异（43.6%vs30.9%）。
使用抗生素患者中(n=144)，测序阳性率显著高于血培养(52.8%vs.25.0%，P<0.01)（图5）。
图5 抗生素使用对检测结果的影响
比较血浆mcfDNA测序与血培养的时效性和病原体
1、时效性比较
表1展示了血培养最常见的8种病原体及时间，不同病原体有所不同。例如，鲍曼不动杆菌从血培养瓶到进出Virtuo系统的时间最短（9.4h），厌氧菌的培养时间最长(34.1 h)。血浆mcfDNA测序时间整体约为26h。
表1 比较血浆mcfDNA测序与血培养的时效性
2、病原体比较
两种方法检测到最多的病原体是鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌（图6）。测序对细菌的检出率明显高于血培养（p < 0.01），厌氧菌的检出率也高于血培养，但由于样本量小差异不显著(p=0.25)，只有测序检测到了病毒。
图6 血浆mcfDNA测序与血培养检测病原体比较
3、连续抽样的病例分析
对11名诊断为混合感染的患者进行连续测序，以监测治疗过程中病原体种类的动态变化。
1例患者重症肺炎早期时，测序快速准确地检测出肺炎克雷伯菌，与BALF培养结果一致，随着病情进展，血液中肺炎克雷伯菌丰度增加，测序检测出肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌混合感染，这引起肺炎加重、脓毒症进一步发展。
1例因鼻咽癌继发呼吸衰竭入住ICU患者，连续检测显示血液中EBV核酸逐渐被清除，但化疗引起患者免疫功能障碍，加剧了鲍曼不动杆菌的感染。
04. 讨论
宏基因组测序已广泛用于临床中病原体检测，血浆mcfDNA测序能够检测难培养病原体，通过捕获和鉴定血液中片段化的mcfDNA来诊断可能的感染，弥补了传统微生物检测方法的不足。在72.4%的ICU患者采样前使用抗生素的情况下，血浆mcfDNA测序对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等的检出率明显高于血培养法。
本研究中，血浆mcfDNA检测脓毒症的灵敏度为68.1%，比血培养高出约28%，这一定程度上是由于血培养的技术不足，以及局部病灶、苛养微生物、血液中活性微生物的载量低。由于细菌直接释放DNA或吞噬细胞释放DNA到血液中，脓毒症患者的细菌cfDNA含量明显高于健康人，因此mNGS能够检测到。
血浆mcfDNA测序诊断脓毒症的特异性低于血培养(64.0%vs.82.6%)，假阳性可能是粘膜屏障受损或免疫抑制造成的，特别是在癌症患者和移植受者中。局部感染患者血浆mcfDNA测序也能检测病原体的核酸。在我们的研究中，非脓毒症组通过血浆mcfDNA测序到的44.8%患者的病原体提示了其他部位的感染，检测到的mcfDNA可能来自一种侵袭性病原体，当组织粘膜受损时，它可能机会性地进入血液，在严重的情况下会导致菌血症或脓毒血症。
血浆mcfDNA测序具有更广泛的病原谱，在32例脓毒症患者中检出两种以上病原体，而血培养往往只有一个物种，这可能由于不同类型的微生物在同一环境中存在竞争。血浆mcfDNA测序也可检测到病毒，是否会引起感染，目前还没有统一的标准，这需要根据患者的病史来判断。例如：在1例患者的血液中检测到人类细小病毒B19核酸，患者临床诊断心肌病，B19表现出心肌趋向性，是心肌炎的常见病因。
我们的数据显示，重症肺炎并发血流感染的可能性很大。最近大量证据表明，血流感染是重症肺炎预后恶化的重要预测因子，早期识别重症肺炎患者的脓毒症或血流感染有助于精确治疗。
研究的局限性包括以下几个方面：血浆mcfDNA测序没有统一的参考标准，本研究的感染性疾病诊断的金标准是对感染患者的综合评价，包括微生物数据的解释、相关的临床生物标志物和临床判断，未对样本进行细菌16SrDNA PCR或真菌28SrDNA-ITS PCR等验证性试验。由于血培养不适合检测病毒，因此本研究没有进行RNA检测，没有通过mcfDNA测序检测血以外的样本，因此可能遗漏了一些局灶性感染，但这不会影响脓毒症的诊断。
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