【文献速递】mNGS应用于骨关节感染多样本的病原检测研究

题目：mNGS应用于骨关节感染多样本的病原检测研究

发表杂志：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

发表时间：2020年10月

IF：4.123

DOI：10.3389/fcimb.2020.00471

研究背景

骨关节感染(Osteoarticular infections，OAI)难以治疗，复发率高，甚至可导致残疾或死亡等严重不良后果。快速准确的病原诊断有助于抗感染治疗或手术方案制定。目前，大多数医院主要病原检测方法是传统微生物培养，但培养阳性率仅为40-70%，且易受到抗生素使用的影响。此外，微生物培养和鉴定往往需要2到14天甚至6周的时间，因此具有一定的局限性。

近些年来，分子诊断技术已经被应用于OAI的诊断中。这些非培养的技术可以在数小时内直接检测到样本中的核酸。16SrRNA/rDNA基因广谱PCR是一种被普遍接受的病原体鉴定方法，但是其不能识别真菌和多种微生物感染，且敏感性不高，只有70%左右。以及多重PCR可以检测到多种特定的病原体，但靶向病原数量有限。微阵列和基于PCR的电子质谱分析能够筛选更多的微生物；然而，目标探针或引物是预先设置的，很难更新。

宏基因组二代测序(mNGS)通过在短时间内（1-6天）的高通量测序和生物信息分析，对临床标本中所有已知微生物进行鉴定。mNGS已被用于检测脑脊液、血液、尿液和支气管肺泡灌洗液样本中的病原体。一些研究报道了使用mNGS方法对假体关节感染（PJI）患者的病原体检测有显著改善（敏感性为88%，特异性为89%）。然而，迄今为止相关研究仅集中在超声液或滑膜液等特定类型的样本上，很少有队列研究报道mNGS在检测OAI患者不同样本类型的病原体能力。另一方面，mNGS检测结果与测序平台、生物信息学分析和实验室环境等因素高度相关，导致mNGS结果解读具有复杂性，需在不同机构进行更多的研究来评估mNGS的诊断性能。

因此，本研究评估了mNGS在实际临床实践中检测不同类型OAI样本病原的性能。

研究目的

评估宏基因组测序(mNGS)作为骨关节感染(OAI)样本中检测病原体诊断工具的性能。

研究对象

     另外，有11例患者的12份样本因取样或运输过程中明显污染、文库构建或测序失败、培养和分子检测样本量不足、儿童样本采集等原因被排除。此外获得了5例骨关节炎所致初次全膝关节置换术患者的5份关节液和5份滑膜组织样本作为衍生样本，以确定实验室和关节腔中潜在的背景微生物。

研究结果

1. 样本特征

在92例OAI患者的130例样本中，关节液84例，超声液24例，组织23例。样本来源包括63个膝盖，59髋，2根肋骨，2个髌骨，2个股骨，1个胫骨和1只手（FIGURE 1B）。PJI采集92份样本，PSA（原发性脓毒性关节炎）采集18份样本，IAI（植入物相关感染）采集6份样本，SSI（手术部位感染）采集11份样本，OM（骨髓炎）采集3份样本（FIGURE 1A）。

2. mNGS测序信息

根据mNGS检测结果，在属水平上确定了124种病原体（FIGURE 2A），在种水平上确定了116种病原体，（FIGURE 2B）。在属水平上，唯一比对reads中位数和相对丰度分别为268和85.8%；种水平上，唯一比对reads中位数和相对丰度分别为192和74.6%。

3. mNGS与微生物培养方法的一致性

130份样本中，84份(64.6%)样本的mNGS和微生物培养结果均呈阳性，9份样本均呈阴性。31份(23.8%)样本仅mNGS检测结果呈阳性，6份(4.6%)样本仅培养结果呈阳性。

在mNGS和培养均为阳性的84份样本中，有58份(69.0%)在种水平上完全一致，13份(15.5%)在属水平上一致。其中84例中有9例（10.7%）被认为是部分匹配的，即多微生物结果中至少检测到一种病原体，84例中4例（4.8%）完全不匹配（FIGURE 3）。

4. mNGS与微生物培养方法检出致病原的比较

在通过mNGS或培养检测的144种病原体中，凝固酶阴性葡萄球菌(n=31)最常见，其次是金黄色葡萄球菌(n=22)、革兰氏阴性杆菌(n=18)、真菌(n=15)、肠球菌(n=11)和链球菌(n=10)。虽然mNGS对凝固酶阴性葡萄球菌、革兰氏阴性芽球杆菌、链球菌、厌氧菌、非结核分枝杆菌和MTCP的检测阳性率高于培养，但唯一有显著差异的是对支原体的检测(p<0.001)。mNGS对肠球菌、真菌、金黄色葡萄球菌检测阳性率低于培养，且无统计学差异（FIGURE 4A）。

5. 不同类型样本mNGS和培养检出结果的比较

所有样本类型中，mNGS检测阳性率(88.5%)显著高于培养(69.2%，p<0.01)。本研究发现，在关节液(86.7% vs.68.7%，p<0.01)和超声液(100% vs.66.7%，p<0.05)中，mNGS阳性结果占比显著高于培养。然而，mNGS与培养对组织样本的差异不显著(p>0.05)（FIGURE 4B）。

6. 既往抗菌治疗对病原体检测的影响

取样前接受抗菌素治疗的78个样本中，mNGS从70个（89.7%）样本中检测到病原体，其检出率显著高于培养组(61.5%, p < 0.01)。同时，在52份未使用抗生素治疗的样本中，mNGS与培养的检出阳性率无明显差异(mNGS: 86.5% vs. culture: 80.8; p > 0.05)（FIGURE 5）。

研究结论

1.mNGS的总体敏感性为88.5%（115/130），显著高于微生物培养69.2%(90/130，p<0.01)。其中，关节液和超声液样本的敏感性更高。这些样品可能是OAI患者mNGS检测的最佳选择。

2.与传统微生物培养方法相比，mNGS对OAI患者支原体的检测更加灵敏（p<0.01）；对凝固酶阴性葡萄球菌、革兰氏阴性芽球杆菌、链球菌、厌氧菌、非结核分枝杆菌和MTCP的检测阳性率高于培养。

3.mNGS与培养相比，对接受过抗菌药物治疗的样本影响较小，这表明mNGS敏感性高，可检测到标本中较低水平的微生物核酸或残留核酸；

4.此外，mNGS被发现能够检测到更多潜在病原体，这些病原体被培养法漏检，这有助于鉴别多种微生物病原体OAI，改善预后。

与常规培养相比，mNGS是一种可靠的检测OAI患者致病原的诊断工具，可作为传统微生物培养方法的补充手段。同时，mNGS技术对于培养难以确诊的，或既往接受过抗生素治疗的患者样本具有更高的诊断价值。

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