Nature | 抗生素持久性表型中的衰老动力学特征

文章题目：抗生素持久性表型中的衰老动态变化特征

发表期刊：Nature

发表时间：2021年11月

影响因子: 49.962

作 者：RacahInstitute of Physics,The Hebrew University of Jerusalem

文章亮点：在细菌遭受应激胁迫后，通过构建随机网络模型来预测细菌抗生素持久性

名词注释：细菌在遭受抗生素胁迫时，其生存机制可分为多种：抗生素持久性（antibiotic persistence）、抗生素耐药性（antibiotic resistance）和抗生素耐受性（tolerance）等。

• 抗生素耐药性（antibiotic resistance）：细菌遭受抗生素胁迫时的存活能力，其生存机制主要通过胞内的抗性因子发挥作用（如：外排泵efflux pump）。抗性因子（resistance factors）能够使耐药细菌在敏感细菌无法耐受的抗生素浓度下保持正常的生长繁殖。

• 抗生素耐受性（tolerance）：细菌遭受抗生素胁迫时的存活机制不依赖于抗性因子，当抗生素被移除后，细菌恢复正常生长。耐受因子（tolerance factors）通常为环境因子或者遗传因子。

• 抗生素持久性（antibiotic persistence）：是种群水平的现象，种群中存在两个亚群，分别为：被抗生素快速杀死的细胞和耐受性强的存活细胞。根据定义，抗生素持久性一词总是与异质群体相关，其中只有一部分群体为耐受性细胞。
  

Part1 研究背景和目的

当细胞受到急性应激时，由于应激反应过于强烈，一些细胞亚群可能处于紊乱状态，使它们不能上调应激反应。比如，当微生物被暴露在饥饿或其他胁迫下，导致生长停滞并触发抗生素持久性。如图1所示，一小部分亚群被迫处于休眠状态，即使细胞被转移到正常生长条件下也会保持这种状态，导致恢复生长的滞后时间（lagtime）延长。当饥饿环境被替换成新鲜培养基时（图1a），大肠杆菌随机地恢复生长，每个细菌恢复生长的滞后时间用一个自动系统（ScanLagsetup5）来确定（图1b）。如果休眠细胞随后暴露在致命的抗生素下，分布于尾部端（tail）的细胞将瞬时休眠状态变成保护状态。因为抗生素需要细胞主动生长才能将其杀死（图1a）。这种休眠细胞所具备的较好生存能力，也被称为"滞后持久性"（persistence-by-lag）。在图1c中，抗生素治疗后存活的细菌比例与滞后时间尾部分布的细胞相关。如果了解影响细菌随机退出休眠的因素，即滞后时间分布，就能预测触发的抗生素持久性水平，正如下面所研究所示。

图1- 滞后时间分布的尾部与抗生素治疗下的存活率相关。a.经过正常培养一段时间后，进行一定时间（Tw，处理等待时间）的饥饿处理--在这段时间里，细菌停止生长，然后重新置于正常营养环境中。在一定的滞后时间后，单个细菌随机地开始重新生长。b，通过监测培养皿上菌落的出现，衡量饥饿处理后，滞后时间（lagtime）的典型分布（Tw=4,320分钟）。在红框中可以看到恢复很长时间后，尾部分布的菌落情况。在插图中，实线表示用相同的数据重绘的1-累积分布函数（1-CDF），表示仍处于滞后期的细菌比例，并能更好地观察尾部分布情况。饥饿结束时，该比例为1（所有细菌都停止生长），随着细菌退出滞后期，该比例下降到0。c,滞后时间分布的尾部部分（这里是4.5小时以上），即滞后时间超过4.5小时的细菌，预测相同时间的抗生素处理下的存活率。蓝色圆圈表示不同Tw的KLY野生型；红色三角形表示KLYtol高存活率的衍生物；误差条表示按菌落形成单位测量的存活率的标准偏差。对于每个菌株，n= 10个独立实验。虚线表示线性回归。

Part2 研究方法

细菌培养条件

将大肠杆菌稀释后，进行过夜培养，温度为32℃。当培养物达到所需的光密度（OD）时，取样，加入SHX。

渐进式SHX饥饿胁迫处理

在含有0.1%卡萨诺酸加0.0625mg/mlSHX的M9培养基中培养细菌。为了在低OD值时细菌停止生长，分两步逐渐施加SHX。(1)在拐点出现后约5小时，SHX的浓度增加到最终浓度的37.5%；(2)在拐点出现后约6.5小时，SHX的浓度达到最终浓度（100%）：0.5mg/ml。

滞后时间分布的测量

在受胁迫前和受胁迫后的数个时间点进行采样。ScanLag程序每15分钟获取一次细菌生长状态的图像。

Part3 研究结果

急性应激后的记忆效应

为了定量恢复生长的滞后时间（lagtime）分布如何取决于急性应激条件下的饥饿时间(Tw)，我们在大肠杆菌指数增长的培养物中加入丝氨酸羟胺（SHX）。SHX诱导氨基酸丝氨酸的饥饿，从导致生长停滞（图2a）。为了施加细菌无法防御克服的急性胁迫，我们使用了严格反应的松弛突变体（relaxedmutant）。在微流控装置中进行的单细胞水平的观察，发现暴露于SHX会导致细菌的生长停滞，并排除了生长停滞是由于死亡和生长的平衡而导致（图2d，e）。

施加SHX一段时间后(Tw)，作者通过测量lagtime分布来检测细菌恢复生长的动态变化。作者发现Tw越长，主导抗生素持久性水平的尾端分布（tail）就越长（图2b，c）。这表明，细菌对接触SHX的总时间Tw保持记忆。在SHX暴露后出现长尾巴可能是因为短尾部分的细菌被杀死，这将使长尾部的细菌富集。作者通过显示SHX下的存活率几乎保持不变，以及通过直接观察大肠杆菌在微流控设备中处于SHX胁迫前期、中期和后期的情况（图2d，e），排除了该因素。结论是，SHX胁迫施加结束后的lagtime分布反映了每个单细胞发生的变化；由于细菌对Tw产生记忆，增加了极长恢复时间的概率。

图2施加SHX胁迫不同Tw后，lagtime的分布。a，生长（虚线）和由于SHX引起的停滞（实线）的光密度(OD)测量值。b，不同Tw对应的lagtime分布。曲线根据a中标记的饥饿持续时间着色。纵坐标为1- CDF，以更好地可视化尾部的分布。c，b图所示的尾部细菌（lagtime高于9.5h）的占比，与Tw的关系。d，单个KLYR大肠杆菌（黄色荧光）在SHX下的生长停滞及其恢复的微流体观察图。在初始生长阶段，细菌在凹槽中生长和分裂并向上迁移。施加SHX后，生长停止。在Tw= 600 min 时，洗涤SHX，细菌随机恢复生长。黑点和白线便于跟踪相同的细菌的生长动态。e，单细胞在SHX下生长停滞的量化（菌株：KLYΔmotA）：97%的细胞停止生长（1%：仅一次分裂；2%：裂解）。在SHX洗涤后，96%恢复生长（见补充方法）。

"衰老"是随机网络的一个普遍属性

上面观察到的细菌对Tw的记忆，以及非指数恢复生长，在许多显示普遍"衰老"的物理系统中都有类似的现象，比如：无定形聚合物，拉伸DNA和自旋玻璃。受依赖于大型随机网络的玻璃系统老化模型的启发，作者开发了一个细胞内分子相互作用网络的统计模型——随机连接循环网络（RCCN），该模型控制着每个单一大肠杆菌细胞在暴露于急性压力期间和之后的行为表现，其示意图见图3a，上下绿色箭头代表处于开启或关闭状态的节点。该网络的每个节点代表细胞网络中的一种化合物（蛋白质和代谢物等），可以处于代表其当前活性的两种状态之一。暴露在SHX中，在模型中被转化为一个持续时间为Tw的力，倾向于使节点关闭（off），并导致生长停滞的中断状态。洗涤SHX后，压力结束，关闭的节点又恢复放松状态。每个单细胞恢复的lagtime是由SHX前OFF节点的比例恢复到原始值（0）的时间决定的。图3b列出了暴露在SHX中不同Tw后，lagtime的分布。

图3- RCCN模型展示了实验中观察到的衰老动态变化。a,RCCN模型示意图。节点（绿色箭头）位于循环圆（蓝色箭头）中，并将其状态传递给下一个节点。循环间通过节点以随机选择的相互作用耦合强度Jij（灰色箭头；厚度表示不同强度）相互连接。网络中每个节点（自旋）状态动态是由Glauber动力学决定的，与连接节点和外部场的相互作用相加。b，从模拟中预测饥饿后滞后时间分布的依赖性（这里绘制为1-CDF的对数尺度）。不同的颜色代表不同的Tw持续时间。c,由于SHX暴露，生长和停止的OD630测量。d,实验结果为突然暴露于SHX后测量的lagtime的分布。不同的颜色代表不同的Tw，对应于c图中采样时间的彩色标记。e.在SHX饥饿恢复期间，9.5小时的氨苄西林处理下的存活率与SHX饥饿持续时间Tw。抗生素下的细菌存活率会随着暴露时间的增加而急剧上升，但Tw的继续增加，细菌存活率会达到饱和。

衰老的饱和度

该模型预测了与观察到的物理衰老类似的几个明显特征。(1）滞后时间的分布取决于应激持续时间；（2）滞后时间的分布包含许多时间尺度，通常表现为非指数衰减；以及（3）滞后时间的分布在足够长的应激持续时间内达到饱和，也就是说，抗生素持久性细菌的比例在长时间的应激暴露下不会进一步增加。

正如模型所预测，SHX压力对大肠杆菌滞后时间分布的影响在Tw>1,000分钟时达到饱和（图3d）。结果表明，当施加SHX的Tw超过1天后，lagtime的分布不受Tw影响。因此，当Tw＞1,000分钟后，产生抗生素持久性细菌的数量和在抗生素处理下的存活率都不会进一步增加（图3e）。

渐进式饥饿

细胞从急性应激中恢复的变异性和衰老可被解释为一个随机网络从中断状态中恢复的动态过程，但不能解释细胞的调节行为。因此，作者预计当细胞暴露在类似强度不大的胁迫下时，响应胁迫的遗传途径会为细胞恢复生长做好准备，并缩短lagtime的分布。在图4中，作者分别进行了2种处理：用SHX进行急性饥饿处理（图4a，虚线）以及逐渐达到饥饿状态的处理（培养物中的氨基酸被慢慢消耗）（图4a，实线）。结果显示，逐渐饥饿并没有导致衰老，也就是说，lagtime的分布并没有随着饥饿时间的延长而改变（图4c）。此外，作者还将指数型生长的细菌培养物暴露于逐渐增加的SHX浓度中，达到与急性暴露于SHX的光密度相同（图4d）。这种渐进式的压力暴露并没有导致衰老（图4f）。正如作者所料，尽管突然饥饿（图4g）和逐渐饥饿（图4f）的培养物条件相似，但滞后时间的分布却非常不同。逐渐饥饿导致细胞间的变化很小，滞后时间分布与快速随机退出一致，特征时间为50分钟（图4c，扩展数据图8b），而突然的SHX饥饿导致广泛的分布，时间尺度长于一天（图3d，4g）。

图4逐渐饥饿状态下不发生衰老。a-c，通过营养物质逐渐耗竭的渐进性饥饿。细菌培养物在指数生长期间暴露于SHX（虚线表示急性应激），或在营养耗尽逐渐饥饿到静止期后暴露于SHX（实线表示逐渐应激）（a）逐渐饥饿状态下的生存能力（b）渐进性饥饿胁迫下，随着Tw的延长，生存力的差异不显著（NS）。cfu，菌落形成单位。（c）逐渐性饥饿（未施加SHX）的lagtime分布。d-f,渐进性饥饿，分几步加入SHX。在细菌指数增长期间，分步添加不同浓度的SHX，在低OD值时生长停止（实线）；虚线表示没有添加SHX，蓝线表示SHX的相对浓度（%）（d）在逐渐施加SHX的饥饿状态下，细菌的生存能力（e）细菌的存活率差异不大。（f）逐步分步加入SHX后，lagtime的分布。使用的菌株是KLYR。f中的颜色于d中颜色代表的含义相同：不同的持续时间。g，急性SHX饥饿后的lagtime分布（图3d的数据为半对数比例，用于比较）。h，急性接触氯霉素后的滞后时间分布。i,j, 渐进式饥饿与急性饥饿示意图,黑线显示了细胞的可能状态。（i）逐渐饥饿导致单个细菌（绿色）的调节反应，其特点是滞后时间分布狭窄，没有出现衰老。（j）急性应激导致细菌的紊乱状态，显示出类似于物理系统中的衰老动态的细胞网络动态和取决于饥饿持续时间的lagtime分布。底部滞后时间分布的不同颜色（绘制为1-CDF）代表不同的胁迫暴露持续时间Tw。

按恢复动力学对胁迫压力进行分类

根据恢复动力学的差异，我们可以根据胁迫是否诱发紊乱状态对其进行分类。在最小的培养基中实施渐进性饥饿实验，以及逐渐暴露在SHX中，使大肠杆菌细胞适应并达到生长停滞状态，此后可以均匀快速地从该状态中恢复（图4b,c, e, f）。最后，作者将所有的胁迫条件重组在一起分析发现，大多数胁迫条件可以归类为导致或不导致衰老。

Part4 研究结论

应激反应使细胞通过激活特定的途径来适应外部条件的变化。在这里，我们研究了受到急性应激胁迫（不致死）的细菌生长的动态变化。结果表明，当施加急性瞬时胁迫时，会抑制细菌的生长，其重新恢复生长的动态变化可以由细胞网络模型来预测，该模型不考虑细胞内具体分子间相互作用。作者观察到，同样强度的胁迫，不同施加方式（急性施加和逐渐施加），会导致完全不同的生长恢复动态。通过测量成千上万个细菌在施加胁迫后的再生动态，表明该模型可以预测细菌的抗生素持久性。本文结果可能解释了常见的抗生素持久性表型，以及试图将其与特定基因联系起来的困难。更广泛地说，本文方法表明，在压力下可以观察到两种不同的细胞状态：一种是调节状态，它为细胞的快速恢复做准备；另一种是由于急性胁迫造成的细胞紊乱状态，具有恢复情况缓慢且具有异质性。细菌的紊乱状态可能是由大型随机网络的一般特性来解释，而非特定的某一发应途径。对细菌紊乱状态地更好理解可以为胁迫下细菌的生存和进化提供新的启示。

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