探究碳青霉烯耐药肺克中基因组特征与耐药程度的相关性
发表杂志：《mSystems》
文章亮点：肺炎克雷伯菌会在血液，尿道和肺中造成严重的感染性疾病。当下的研究中，对于不同耐药因素联合对MIC影响的研究较少。作者通过对166株肺克进行测序发现，blaKPC的拷贝数和部分膜蛋白突变会引起更高水平的碳青霉烯耐药。相反地，一个特殊的膜蛋白ompK37和低水平的碳青霉烯MIC值相关。本研究加深了我们对不同耐药因素对碳青霉烯耐药贡献的理解。
1、研究背景
耐碳青霉烯肠杆菌目细菌（CRE）被世界卫生组织定义为十分紧急的公共卫生威胁和最关键优先级的病原菌。由于在全球广泛传播且治疗手段有限，CRE被认为是细菌感染中最主要的威胁。CRE感染也和高死亡率相关联，死亡率高达20%-50%。最常见的碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌包括肺炎克雷伯菌，部分肠杆菌属细菌和大肠杆菌，其中，肺克占所有CRE感染的57%-74%。碳青霉烯耐药机制有多种，根据不同地域也有所不同。
产碳青霉烯酶是世界范围内最常报道的肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药机制，分子诊断方法已证明绝大多数的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CR-Kp）都含有碳青霉烯酶基因如肺炎克雷伯碳青霉烯酶（blaKPC）和新德里金属-β-内酰胺酶（blaNDM）。碳青霉烯酶的存在通常都会预示着碳青霉烯耐药表型，但碳青霉烯耐药程度（MIC）在这些菌株中各异。碳青霉烯MIC的这种多样性可能是由其他因子导致的，同时这些因子也影响了产碳青霉烯酶和非产碳青霉烯酶CRE的碳青霉烯耐药性。CR-Kp中观察到的一些基因水平变异，如碳青霉烯酶基因拷贝数或转座子亚型和启动子区域的变化，改变了碳青霉烯酶基因的表达水平，这可能解释碳青霉烯MICs的部分多样性。其他与碳青霉烯酶表达无关的因素也可能增加碳青霉烯MICs，包括超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的表达，尤其是ESBLs的表达和孔蛋白缺失导致的碳青霉烯膜通透性相结合的时候。
这些导致碳青霉烯耐药的因素大部分是单独进行研究的，很少有数据确认在临床收集的CR-Kp菌株中，它们联合时对碳青霉烯MIC的影响。我们对166株临床肺炎克雷伯菌分离株进行了基因组鉴定，以评估碳青霉烯类耐药水平与基因组的相关性。
2、研究目的
探究影响CR-Kp碳青霉烯类耐药水平的基因层面特征。
3、研究方法
1. 临床分离株收集及碳青霉烯类耐药检测
对174株CR-Kp分离株进行回顾性分析，这些分离株是作为常规临床护理的一部分而回收的。这些分离株于2010年10月至2016年2月期间从美国一家三级护理医院（芝加哥西北纪念医院）的患者中收集。碳青霉烯抗性定义为在Vitek2系统进行MIC测试并使用CLSI折点判断后，显示对碳青霉烯的耐药性 ≥1 mg/L。CR-Kp菌株被医院微生物实验室作为常规机构感染控制政策的一部分在-80℃下备案和储存。随后，通过在LB固体培养基上划线并在37℃孵育过夜复苏菌株。为保证纯度，从平板中选择单个菌落进行低温保存。在LB琼脂上再培养分离株，根据生产厂家的规格，使用Etest测试条带（bioMérieux）测定其对美罗培南、厄他培南和亚胺培南的MIC，确定对碳青霉烯的耐药性。在测试后对所有碳青霉烯均无耐药性的分离株被排除在研究之外。根据制造商的规格，将观察到的MIC值四舍五入到下一个最高的log2稀释度。MICs ＞32 mg/L的值转换为64 mg/L进行统计分析。从每个患者中分离的第一个菌株才用于分析。从直肠拭子中提取的分离株也被排除在本研究之外。
2. 全基因组测序
菌株在37℃下LB肉汤中震荡培养过夜，根据制造商说明，使用带有细胞DNA纯化试剂盒的Maxwell 16仪器进行DNA提取（Promega Corporation, Madison, WI）。使用Illumina Nextera XT试剂盒制备文库，并使用Illumina HiSeq （150-bp双端测序）平台（Illumina, Inc.，San Diego, CA）进行测序。序列用Trimmomatic v0.32裁剪，用SPAdes 3.9.1进行denovo装配，剔除长度小于200 bp或平均覆盖深度＜5×的Contigs。
3. CR-Kp基因组分析
多位点序列分型（MLST）使用MLST 1.8分析每个组装的序列（Center for GenoMIC Epidemiology）。通过将CR-Kp基因组与CARD数据库和ResFinder v3.1进行比对，确定耐药基因。使用bwa v0.7.15对全基因组测序reads与ST258参考基因组KPNIH1 （NZ_CP008827.1）进行比对。使用bcftools v1.9确定相对于参考序列的变异，使用的最低碱基质量为25，最低比对质量为30。为了检验blaSHV （ESBL）、blaCTX-M和blaKPC基因拷贝数是否有助于提高碳青霉烯MICs，使用sam_to_coverage（https://github.com/egonozer/sam_to _coverage/blob/master/sam_to_coverage.pl）将每个分离株β-内酰胺酶测序reads的平均数目归一化为核心基因组测序reads的总数；该比值用于预测β-内酰胺酶基因相对于核心基因组的拷贝数。
为了区分blaKPC基因本身的复制和携带blaKPC的整个质粒拷贝数的增加，我们将blaKPC的平均reads覆盖率与携带blaKPC-3的pRYCKPC3.1质粒（NC_019151.1）上其他5个基因的平均reads覆盖率进行了比较。通过将blaKPC基因的上游序列与已发表的参考序列进行比对，分析了含有blaKPC基因的转座子异构体。
4. 数据和回归分析
为了确定不同临床相关基因对厄他培南、亚胺培南和美罗培南MIC的综合影响，通过逐步采用多元线性回归方法，评估表型碳青霉烯MIC与一个或多个鉴定的感兴趣基因型标记相关的增量变化。碳青霉烯MIC模型采用Etest（即，2、4、8和16 mg/l）观察。基于流行率、生物学合理性和/或先前的研究，在＞1分离株中发现的任何基因组元素都符合模型纳入条件。因此，最初考虑的候选变量（基因型）如下: blaMPC存在情况、blaCTX-M存在情况、blaCTX-M拷贝数、blaKPC存在情况、blaKPC拷贝数、blaFOX-5存在情况、blaOXA -232存在情况、blaOXA （非碳青霉烯酶）存在情况、blaSHV（非ESBL）存在情况、blaSHV （ESBL）存在情况、blaTEM存在情况、blaVEB-9存在情况、ompK35/36/37的预测功能和转座子亚型。P ＜0.05被认为在最终模型中具有统计学意义。采用调整后的R2（aR2）评估模型性能。通过公差和方差膨胀因子评估共线性。异常值、高度影响值和杠杆点没有删除，因为它们是真实的观察值。使用SPSS version 26（IBM公司，Armonk, NY）进行多元线性回归分析。
4、研究结果
1、CR-Kp菌株特征
从美国西北纪念医院（Northwestern Memorial Hospital）收集从2010年10月至2016年2月的CR-Kp166株。166株肺炎克雷伯菌对厄他培南、亚胺培南和美罗培南的耐药比例为分别为97.6%（162/166）、77.1%（128/166）和71.1%（118/166）。菌株的主要来源是尿道（n = 87），其次是呼吸道（n = 46），血液（n = 13）和其他来源（n = 20）。大部分CR-Kp菌株（74.1%[123/166]）属于ST258 分型，而ST14、ST15和ST16分型的菌株分别为10、12和6株。序列分析结果表明，166株CR-Kp分离株中有158株（95.2%）至少携带1个碳青霉烯酶基因（图1）。
平均而言，非产碳青霉烯酶的CR-Kp （n = 8）菌株的亚胺培南MIC和美罗培南MIC均低于产碳青霉烯酶的菌株，而产碳青霉烯酶和非产碳青霉烯酶的菌株的厄他培南MIC则分布相似（图2A-C ）。每个菌株的三类碳青霉烯药物MIC倾向于同时增加（图2D ）。也有少数菌株厄他培南相比于亚胺培南和美罗培南MIC更高。blaKPC-3基因是最常见的碳青霉烯酶基因，153株（92.2%）分离株中存在blaKPC-3基因，2株（1.2%）分离株中存在blaKPC-2基因。剩下的3株含有碳青霉烯酶基因CR-Kp分离株中，其中1株含有blaOXA-232, 1株同时含有blaOXA-232和blaNDM-7, 1株含有新的blaKPC变体。
研究结果表明，来自采集地点的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药主要是由blaKPC-3造成。然而，尽管携带相同的碳青霉烯酶基因，blaKPC-3阳性分离株的MICs还是有显著差异。对每株分离株进行验证，发现其blaKPC-3基因序列完全相同。由于单凭碳青霉烯酶基因无法预测碳青霉烯MIC，因此我们还探索了其他的基因型-表型的关系。
图1 最终分析中包含的 166 个 CR-Kp 分离株的核心基因组系统发育树和相应的基因型/表型分离株信息。序列类型和胶囊基因座类型（如果预测）列在每个分离株旁边。对美罗培南、厄他培南和亚胺培南的碳青霉烯MIC由绿色（低MIC）到红色（高MIC）的梯度表示。蓝色和橙色分别表示菌株中是否存在碳青霉烯酶基因或其他β-内酰胺酶基因。blaKPC拷贝数用黄色（低）到红色（高）的梯度表示。ompK35、ompK36和ompK37外膜孔蛋白通道基因的状态用深紫色（野生型等位基因）、浅紫色（有意义不明的突变等位基因）和灰色（缺失或截短的等位基因）表示。转座子异构体以蓝色（Tn4401a）、黄色（Tn4401b）、绿色（Tn44401d）和橙色（Tn4401e）表示。厄他培南的敏感性和耐药性折点分别为≤0.5 mg/L和≥2 mg/L。亚胺培南和美罗培南的敏感性和耐药性折点分别为≤1 mg/L 和 ≥4 mg/L
图2 从Etest中获得的含碳青霉烯酶(蓝色)和不含碳青霉烯酶(绿色)的CR-Kp分离菌株的厄他培南(A)、亚胺培南(B)和美罗培南(C)的MICs分布。(D)所有三种碳青霉烯类化合物在CR-Kp菌株中的表型MIC分布。圆圈代表具有相应的厄他培南、亚胺培南和美罗培南MIC的分离株；圆圈的颜色与美罗培南MIC相对应，圆圈的大小与具有该表型分离株的数量相对应（例如，右上角的棕色大圆圈代表11个CR-Kp分离菌株，其厄他培南、亚胺培南和美罗培南MIC分别为＞32 mg/L、＞32 mg/L和 ＞32 mg/L）
2. 基因型与碳青霉烯耐药性之间的关系
1) 外膜孔通道改变
外膜孔蛋白允许β-内酰胺（包括碳青霉烯）通过并到达细菌周质空间中的结合位点。因此，我们探究了ompK35、ompK36和ompK37基因型与碳青霉烯MICs之间的关联。据预测，有35株（21.1%）CR-Kp分离株携带有功能的ompK35孔蛋白通道，而129株（77.7%）的ompK35基因中含有提前终止密码子或插入序列（2株不能确定与表型相关，并从这些分析中排除）。ompK35基因中过早终止密码子或插入序列的存在与厄他培南、亚胺培南和美罗培南MICs增加相关（P＜0.005）（图3A）。相反，大多数CR-Kp分离株的ompK36基因（135株；81.3%）与野生型基因相同，预计能编码正常功能的ompK36蛋白。仅有8株（4.8%）具有提前终止密码子或ompK36基因缺失，且菌株的亚胺培南MIC显著降低（P = 0.019）（图3B）。最后，针对ompK37基因，虽然37株（22.3%）中存在一些没有验证过对孔蛋白功能影响的突变，但所有分离株中都未包含具有提前终止密码子的ompK37基因。有趣的是，具有ompK37突变的分离株对厄他培南、亚胺培南和美罗培南MIC值的中位数，比具有ompK37野生型基因的CR-Kp显著低于2倍（P＜0.005，针对每个碳青霉烯药物）（图3C）。
图3
每个CR-Kp分离株的厄他培南（紫色）、亚胺培南（橙色）和美罗培南（绿色）MIC值按OmpK35（A）、
OmpK36（B）和OmpK37（C）外膜蛋白的功能类型分层。
2) 携带blaKPC基因的转座子
在一些CR-Kps中发现不同的Tn4401转座子亚型可能影响blaKPC的表达。在156株带有blaKPC的CR-Kp分离株中，大多数在Tn4401d转座子亚型中携带blaKPC基因（n = 119；76.3%）；其中1株有1个单核苷酸变异（SNV） （C6941A），其余序列与Tn4401d参考序列相同。其次是Tn4401b转座子亚型（n = 34；21.8%），但只有3个分离株的序列与文献相同（accession CP017937）；其中1株在P2启动子区域有1个SNV （G6909A）， 30株有5个SNV，其中4个SNV位于P1启动子区域（T7148G、T7152G、A7153T、C7154A和C7158A）。其中1株带有Tn4401a转座子，1株带有Tn4401e转座子，还有1株转座子落在contig的末端，无法分型。含有Tn4401d的分离株碳青霉烯类MIC平均比含有Tn4401b的分离株高1.9 ~ 5.2 mg/L，亚胺培南和美罗培南MIC值呈显著增加趋势（图4）。同时作者也发现ESBLs基因的存在与碳青霉烯MIC值并没有显著的关联。
图4
每个 CR-Kp 分离株的厄他培南（紫色）、亚胺培南（橙色）和美罗培南（绿色）MIC值按blaKPC基因所在的转座子类型分层。
黑线代表每组的中值MIC。MIC值＞32 mg/L转换为64 mg/L进行分析
3) blaKPC基因的相对拷贝数
blaKPC高拷贝数会导致KPC酶的表达增高并和碳青霉烯MIC升高有关。在包含blaKPC基因（blaKPC-2或blaKPC-3）的CR-Kp亚群中，更高的blaKPC相对拷贝数与更高的厄他培南、亚胺培南和美罗培南的MIC显著相关（P＜0.005）（图5A-C）。虽然差异显著，但正相关性较弱。亚胺培南的相关性最强（r = 0.41），其次是美罗培南（r = 0.37），厄他培南MICs的相关性最弱（r = 0.27）。与blaKPC基因＜4 copies（n = 135；86.5%）的CR-Kp分离株相比，blaKPC基因＞4 copies（n = 21；13.5%）分离株的厄他培南（P = 0.019）和亚胺培南中位MIC分别高出4倍和2倍（P = 0.021），而美罗培南中位MIC有显著升高的趋势（P = 0.067）（图5D）。这些发现表明，菌株blaKPC基因拷贝数的增加往往导致碳青霉烯MICs的升高。
图5
每个 CR-Kp 分离株中的相对blaKPC拷贝数与其厄他培南 (A)、亚胺培南 (B) 和美罗培南 (C) MIC值之间的关系，
其中“r”代表 Spearman 相关系数。
(D) 对具有＜4个blaKPC基因拷贝和具有 ≥4 个blaKPC基因拷贝的分离株的碳青霉烯类 MIC 进行比较。
黑线代表每组的中值MIC。MIC值＞32 mg/L转换为64 mg/L进行分析
4) 多元线性回归分析
作者用多元线性回归分析评估了与每种碳青霉烯MIC变化显著相关的CR-Kp的基因。最终得到的模型包含了一些在前述分析中已发现的碳青霉烯耐药相关因子，包括blaKPC拷贝数、blaOXA-232存在情况以及ompK35或ompK36等位基因（表1）。每增加一个blaKPC基因的拷贝，碳青霉烯的MIC就增加3.37 mg/L至4.85 mg/L，而ESBL基因的拷贝数与碳青霉烯MICs无关。blaOXA-232的存在与MIC增加44.36 mg/L至65 mg/L相关。
同时，作者也通过机器学习的方法进行了高水平碳青霉烯耐药（＞8 mg/L）和低水平碳青霉烯耐药（≤8 mg/L）的分类尝试（亚胺培南、美罗培南），但结果并不理想（F1分数0.30-0.54）。
表1 多重线性回归分析表明，检测到的基因型预测因素对166个CR-Kp分离株的厄他培南、亚胺培南和美罗培南MIC值的影响
5、讨论
一个可能影响研究的单变量和多变量分析的重要限制是，可测试到的碳青霉烯MICs最大浓度为32 mg/L。因此，任何MIC＞32 mg/L的分离株都被转换成MIC = 64 mg/L进行统计评估，然而这些CR-Kp分离株实际上可能具有不同水平的碳青霉烯耐药性。更精确的确定碳青霉烯MICs可能会影响分析的结果。另一个潜在的限制是，这些分离株是从单一机构收集的，这可能会限制将本文研究结果应用到其他具有不同CR-Kp基因型的医疗中心。然而，作者收集的CR-Kp的普遍特征与大部分其他研究人员发现的耐药菌株相似，至少在美国是如此。另外一个限制是，短reads测序被用于所有分离株的基因组特征，因此作者无法确定质粒序列，可能错失能够影响blaKPC表达的新质粒插入、删除和重排。
综上所述，作者收集并对166株CR-Kp菌株进行了深入的分子层面的分析，多元线性回归模型确定了与碳青霉烯MICs显著变化相关的基因水平特征。该模型支持了几种生物学上合理的基因特征，其在临床CR-Kp分离株中与碳青霉烯类MIC水平具有相关性，包括blaKPC拷贝数和外膜孔蛋白功能类型。相反，ESBL基因的存在或其拷贝数的增加与碳青霉烯MICs无关，这表明它们不会增加携带碳青霉烯酶基因的分离株对碳青霉烯的耐药性。最后，我们的数据还显示了Tn4401d菌株中碳青霉烯MICs有增加的趋势。机器学习并没有显著提高基于序列预测分离株MICs水平的能力。未来的研究有必要进一步完善模型，并充分确定这些基因在碳青霉烯耐药中的作用。
关于金匙医学
金匙医学成立于2017年，坐落于北京昌平中关村生命科学园，公司不断深耕分子诊断技术在感染领域的应用。金匙医学与上海交通大学医学院附属瑞金医院、山东大学齐鲁医院、中国医学科学院血液学研究所血液病医院、郑州大学第一附属医院、陆道培医疗集团等知名院所建立了深入合作关系，服务临床千余家，面向呼吸、血液、检验、重症、感染等科室，提供病原微生物宏基因组诊断产品及检测服务的整体解决方案。
金匙医学已完成四轮融资，母公司及子公司天津金匙于2020年双双取得国家高新技术企业证书认定，并于2019年和2020年蝉联清科集团评选的Venture 50最具投资价值企业，连年入选动脉网“中国创新医疗服务榜TOP100”，在2020年中关村国际前沿科技创新大赛中荣登“病毒检测技术TOP10榜单”，2021年获得北京市“专精特新“中小企业证书，2021年评为”天津市企业技术中心”。
金匙医学已发布基于二代测序和三代测序病原微生物高通量检测产品，实现了进口和国产测序平台并双双高分通过国家临检中心mNGS室间质评。并创新性推出直接针对临床样本进行宏基因组分子药敏表型预测的产品GenseqAMR。在血液样本领域，金匙医学已推出血浆及血细胞检测组合解决方案，其中，金识原®针对血浆层核酸检测已在国际检验学知名期刊《Clinical Chemistry》发表系统性临床研究性能验证文章，目前该产品已通过中检院注册检并进入NMPA三类注册临床研究。
金匙医学在北京、上海、广州、天津拥有自己的医学检验实验室，面积超过19000m2，在武汉、成都、西安等与当地医学实验室均有合作。此外，金匙医学协助郑州、深圳、南昌、济南、昆明、海口、南京等多家三甲医院实现院内开展病原基因检测项目。
金匙医学管理团队多位成员来自知名外资药企、硅谷著名临床诊断公司以及国内成功基因检测类公司的管理层，从业时间在二十年以上。公司现有员工500余人，企业90%以上人员为生命科学和临床医学背景，普遍在基因测序、医药、诊断企业，医疗机构和微生物研究机构工作多年。企业20%以上人员拥有博士学历，50%以上人员拥有硕士学历。
金匙医学已获得数个I类，II类注册证，4项已授权发明专利，50余项计算机软著，8个注册商标，并与多家顶级临床院所深入合作，发表20余篇高分SCI文章，其中共一和共通讯作者文章5篇。2020年7月，金匙医学研发的“病原微生物测序数据分析软件”成功获得医疗器械注册证。
